《Cells》：Role of Alternative Splicing and Polyadenylation in Regulation of Spleen Development
Jinghao Cui,
Rongru Zhu,
Mengke Song,
Yuanlu Sun,
Yu Pang,
Ming Tian,
Xinmiao He,
Di Liu and
Xiuqin Yang
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这项研究（非综述）整合PacBio全长转录本测序（Iso-seq）与短读长RNA测序（RNA-seq），系统描绘了猪脾脏在30日龄与90日龄两个发育阶段的转录组多样性。研究发现脾脏存在广泛的转录本多样性，鉴定出大量新转录本，并揭示可变剪接（AS）与可变多聚腺苷酸化（APA）是调控脾脏免疫发育的关键转录后机制。研究指出，免疫相关基因主要通过切换主要转录本亚型（AMT）而非改变整体表达水平来调控发育，并且基因呈现随年龄增长偏好使用远端多聚腺苷酸化位点（PAS）的趋势。此外，研究首次通过分子生物学技术验证了MYBL2/WEE1和E2F1/WEE1等调控轴。这些发现不仅完善了猪基因组注释，也为深入探索脾脏发育的分子机制提供了重要基础。
脾脏作为机体最大的次级淋巴器官，在先天性与适应性免疫应答中扮演着核心角色，其发育过程受到精细的分子调控。可变剪接（Alternative Splicing, AS）与可变多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation, APA）是重要的转录后调控机制，能够从一个基因产生多个具有不同功能的转录本亚型，极大地丰富了转录组与蛋白质组的多样性。然而，关于AS和APA在脾脏发育过程中的全基因组水平研究仍很缺乏。本研究以30日龄和90日龄的民猪脾脏组织为材料，创新性地结合了PacBio第三代全长转录本测序技术（Iso-seq）与Illumina短读长RNA测序（RNA-seq），旨在全面解析猪脾脏发育过程中的转录本多样性及其动态变化规律。
研究首先通过Iso-seq构建了高精度的猪脾脏全长转录组。测序共获得了超过100万条环形一致性序列（CCS） reads，经过严格质控和过滤后，最终得到了包含23,818个转录本的脾脏转录组图谱。令人瞩目的是，其中高达72.61%（17,294个）的转录本是未被现有猪参考基因组注释的新转录本，它们主要来源于已知基因，这表明当前猪的基因组注释仍不完善，脾脏中基因的转录本多样性被严重低估。这些新转录本通常比已知转录本更短、外显子数更少、表达水平也更低。在免疫相关基因中，如免疫球蛋白重链恒定区μ（IGHM）、组蛋白去乙酰化酶10（HDAC10）和集落刺激因子1受体（CSF1R）等，都发现了异常丰富的新转录本，提示AS和APA在免疫相关基因的功能调控中可能具有特殊重要性。
进一步对可变剪接事件的分析表明，AS是产生转录本多样性的主要驱动力。在脾脏组织中，共鉴定出7467个AS事件，涉及3084个基因。其中，外显子跳跃（Exon Skipping, ES）和内含子滞留（Intron Retention, IR）是最常见的两种AS类型。研究还发现，转录本数量与外显子数量、基因表达水平呈正相关。对转录本数量最多的前500个基因进行KEGG通路富集分析，结果显示它们显著富集于剪接体、抗原加工与提呈、EB病毒感染等与疾病发生和免疫功能密切相关的通路，这从功能层面印证了高度复杂的转录本多样性与免疫系统的密切关联。
研究的核心发现之一是，在脾脏发育过程中，基因调控免疫发育的主要策略是切换占主导地位的主要转录本（Major Transcript, MT），而非简单地改变基因的整体表达水平。通过整合Iso-seq的转录本结构信息与RNA-seq的表达定量数据，研究定义了1824个在两个发育阶段拥有不同MT的基因，即替代主要转录本（Alternative Major Transcript, AMT）基因。这些AMT基因的富集通路与差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）的富集通路存在明显区别：AMT基因显著富集于溶酶体、内吞作用、TNF信号通路、NOD样受体信号通路等与免疫和健康直接相关的通路；而DEGs则主要富集于细胞周期、DNA复制、p53信号通路等与细胞生长和DNA修复相关的通路。这一对比强烈提示，在脾脏发育，特别是免疫系统成熟过程中，生物体更倾向于利用AS产生的不同转录本亚型（即AMT）来精确调控免疫功能。
除了AS，研究也对APA进行了深入分析。共鉴定出1490个发生APA的基因，平均每个APA基因含有约2.83个多聚腺苷酸化位点（Polyadenylation Site, PAS）。对PAS使用偏好的分析揭示了一个有趣的现象：无论是在30日龄还是90日龄，大多数基因的主要PAS（mPAS）都位于3‘-非翻译区（3’-UTR）的远端。更重要的是，随着日龄增长（从30天到90天），偏好使用远端PAS（定义为M基因）与偏好使用近端PAS（定义为P基因）的基因数量比值从2.18增加到了2.33，表明在脾脏发育过程中，基因呈现出年龄依赖性的、越来越倾向于使用远端PAS的趋势。APA会导致3‘-UTR长度发生变化，从而影响mRNA的稳定性、定位及与miRNA或RNA结合蛋白的相互作用。为了验证APA的调控功能，研究选取了ZC3H14、REEP5和DLL1三个基因的不同长度3’-UTR进行双荧光素酶报告基因检测。结果一致表明，较短的3‘-UTR能够驱动更强的报告基因表达，这为APA通过改变3’-UTR长度来调控基因表达提供了直接的实验证据。
最后，研究通过生物信息学分析与分子生物学实验相结合，深入探索了调控脾脏发育的关键转录因子（Transcription Factor, TF）及其调控网络。从93个差异表达的TF中，筛选出连接度最高的五个TF：E2F8、FOXM1、WDHD1、E2F1和MYBL2。进一步构建其与靶基因的互作网络，发现FOXM1、E2F1和MYBL2处于网络枢纽位置。研究随机选择其中一个靶基因——细胞周期调控关键激酶WEE1进行深入的功能验证。生物信息学预测发现WEE1基因启动子区存在三个E2F1和一个MYBL2的潜在结合位点。RNA-seq数据显示，在90日龄脾脏中，MYBL2、E2F1和WEE1的表达量均显著下调。
随后，研究通过一系列实验证实了MYBL2和E2F1对WEE1的直接转录调控作用：双荧光素酶报告实验表明，突变或删除这些预测的结合位点会显著降低WEE1启动子的活性；而过表达MYBL2或E2F1则能显著增强WEE1启动子的活性，且这种增强效应在结合位点突变后被削弱。在细胞水平，过表达MYBL2或E2F1能同时上调WEE1的mRNA和蛋白水平。电泳迁移率变动分析（EMSA）进一步证实，MYBL2和E2F1的蛋白能够直接与预测的DNA序列探针结合，且该结合可被特异性竞争探针所竞争，而被突变探针所影响。这些结果首次在分子层面验证了MYBL2/WEE1和E2F1/WEE1这两个调控轴的存在，证实了关键TF通过直接结合靶基因启动子来调控其表达，从而参与脾脏的发育过程。
综上所述，本研究通过先进的转录组学技术结合严谨的分子实验，系统描绘了猪脾脏发育中由AS和APA介导的复杂转录调控图谱。研究不仅极大地丰富了猪脾脏的转录组注释资源，更重要的是揭示了“切换主要转录本亚型”是免疫发育调控的一种核心策略，并发现了基因在发育中“偏好使用远端多聚腺苷酸化位点”的年龄依赖性趋势。所鉴定的关键转录因子及验证的调控通路（如MYBL2/WEE1、E2F1/WEE1）为深入理解脾脏生长发育和免疫功能的分子机制提供了新的线索和扎实的研究基础。
