人源肠道 Blautia hominis菌株 HA2291 的体外胆固醇转化功能表征及其分子机制

《Nutrients》：An In Vitro Functional Characterization of the Cholesterol-Transforming Blautia hominis Strain HA2291 Isolated from the Human Gut Warren Chanda, He Jiang and Shuang-Jiang Liu

本研究通过对人体肠道来源的63株布劳特氏菌（Blautia）进行体外筛选，发现包括 B. hominisHA2291在内的多个菌株具有显著降低胆固醇的能力（活菌31%-78%，热灭活菌8%-64%）。添加胆盐（oxgall）可增强活菌的胆固醇去除效果（提升至74%-83%）。研究聚焦于活性最强的HA2291菌株，通过代谢组学、转录组学和蛋白质组学联合分析，揭示了其将胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮和表胆甾烷醇的代谢途径，并鉴定出SCP2样蛋白RS03310是关键的胆固醇互作因子，其重组蛋白在体外可催化NAD+依赖的胆固醇氧化反应。这些发现为阐明 Blautia属细菌调节宿主胆固醇稳态的潜在机制提供了直接的体外实验证据。

　　

1. 引言

高胆固醇血症是心血管疾病（CVD）的主要可调控风险因素。当前降胆固醇疗法如他汀类药物长期使用存在副作用，促使人们寻找替代或补充性管理策略。肠道菌群在调节宿主生理功能，尤其是代谢健康方面扮演关键角色，可通过多种机制如产生胆汁盐水解酶（BSH）、直接同化胆固醇或将其转化为难以吸收的粪固醇（如粪烷醇）来调控胆固醇代谢。布劳特氏菌（Blautia）作为一种重要的肠道共生菌，与代谢健康相关，但其影响胆固醇代谢的遗传与分子机制尚不明确。本研究旨在填补这一知识空白，从健康人粪便中分离和鉴定具有降胆固醇潜力的 Blautia菌株，通过体外筛选验证其活性，并对 Blautia hominisHA2291菌株进行多组学分析，以鉴定参与胆固醇代谢的候选基因。

2. 材料与方法

2.1. 粪便样本制备与 Blautia菌株分离

研究从四名至少三个月未使用抗生素的健康捐赠者处收集新鲜粪便样本，立即处理。样本经均质、过滤、稀释后涂布于改良的Gifu厌氧培养基（mGAM）平板上，在37°C厌氧条件下培养2-9天。挑选典型菌落进行纯化，通过16S rRNA基因测序鉴定为 Blautia属。菌株储存于-80°C。

2.2. 降胆固醇菌株的筛选

将新鲜细菌培养物接种于含有或不含100 μg/mL胆固醇的mGAM肉汤中，以评估胆固醇对细菌生长的影响。利用邻苯二甲醛比色法，分别评估活菌和热灭活菌株在含胆固醇培养基（含或不含0.3%牛胆盐（oxgall））中的胆固醇去除能力。胆固醇去除率计算公式为：胆固醇去除(%)=C0C0?C1×100，其中C₀和C₁分别为对照和接种培养基中的胆固醇浓度。

2.3. Blautia的胆固醇代谢分析

采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS）对 B. hominisHA2291在含胆固醇培养基中培养后的代谢物进行分析。样品经皂化、脂质提取后上机检测，通过与数据库比对鉴定胆固醇及其转化产物。

2.4. 转录组分析与降胆固醇相关基因功能研究

将 B. hominisHA2291接种于含或不含胆固醇的培养基中培养48小时，收集菌体进行转录组测序。基于分析结果，筛选出候选基因RS03310（一种含固醇结合域的蛋白-2），将其在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白。通过沉淀结合实验评估蛋白与胆固醇的结合能力，并通过监测340 nm处吸光度（A₃₄₀）的升高，测定重组RS03310蛋白在体外催化NAD⁺依赖性胆固醇氧化的酶活性。

3. 结果

3.1. 菌株筛选与胆固醇去除

从63株 Blautia菌株中，有9株表现出显著的胆固醇去除能力。活菌的去除率为31%-78%，热灭活细胞的去除率为8%-64%，表明存在依赖于细胞活性的转化机制以及细胞表面的物理吸附作用。其中，B. hominisHA2291、Blautiasp. HA3515和 B. coccoidesHA4419活性最强。添加牛胆盐（oxgall）后，活菌的胆固醇去除率提升至74%-83%，显示其在模拟肠道胆汁环境下的耐受性和增强的代谢活性。

3.2. 代谢产物鉴定

代谢组学分析揭示，B. hominisHA2291能将胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮和表胆甾烷醇，这是胆固醇向粪烷醇转化的中间产物。

3.3. 候选基因鉴定与功能验证

转录组分析发现，在胆固醇存在下，基因RS03310显著上调。该基因编码一个类似于固醇载体蛋白2（SCP2）的蛋白。体外功能实验表明，重组RS03310蛋白能够与胆固醇结合，并且以NAD⁺为辅因子，在体外催化可测量的胆固醇氧化反应，产生NADH，其比活性经计算为具体数值（基于公式计算）。

4. 结论

本研究首次在体外系统地表征了人源 Blautia菌株，特别是 B. hominisHA2291的胆固醇转化能力。结果表明，该菌株可能采用多种策略降低胆固醇水平，包括细胞表面吸附（热灭活细胞作用）、胆汁增强的去除（oxgall效应）以及酶促转化。其中，SCP2样蛋白RS03310被确定为参与该过程的关键候选基因。这些发现为理解 Blautia在调节宿主胆固醇稳态中的潜在作用提供了新的分子机制见解，并突出了RS03310作为与胆固醇生物转化相关的一个有前景的候选基因。