《Nutrients》：Integrated Proteomics and Metabolomics Reveal the Direct Hepatic Protection of Propionate Against Alcoholic Liver Disease via the RGN-PPARα Pathway
Haidi Wang,
Haitao Liu,
Miaoxin Wang,
Tengjiao Chi,
Fengting Liu,
Xinyan Qu,
Yan Mu,
Qi Xu and
Quanbo Wang
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这篇研究性论文揭示了短链脂肪酸丙酸盐（Propionate）在急性酒精性肝病（ALD）中的直接肝保护机制。研究通过整合蛋白质组学和代谢组学分析发现，丙酸盐可重塑肝脏蛋白与代谢物谱，通过上调钙调蛋白（RGN）激活下游PPARα信号通路（涉及p-AMPK、PPARα、ACOX1、CPT1A等关键分子），从而协同促进脂解、增强脂肪酸β-氧化（β-oxidation）并强化抗氧化防御，最终恢复肝脏脂质稳态，缓解酒精性肝损伤。该研究为丙酸盐治疗ALD提供了新的肝脏中心性（liver-centric）机制见解和治疗潜力。
引言与研究背景
酒精相关肝病（ALD）是全球范围内最普遍的肝脏疾病之一，其病理谱从脂肪变性（steatosis）逐步发展为脂肪性肝炎、纤维化、肝硬化，最终可能导致肝细胞癌。酒精是肝硬化及相关死亡的主要原因，而目前针对ALD的临床治疗选择有限。近年来，肠道微生物组研究强调了有益微生物代谢物的治疗潜力，特别是短链脂肪酸（SCFAs），包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。丙酸盐因其良好的生物相容性和广泛的生物功能而受到关注。以往研究表明丙酸盐可通过维持肠道-肝脏轴稳态来改善慢性ALD，但其直接作用于肝脏的保护机制尚不明确。本研究旨在利用急性ALD模型，最小化肠-肝轴干扰，探究丙酸盐的直接肝保护作用及其内在分子机制。
材料与方法
研究使用了雄性C57BL/6J小鼠建立急性酒精性肝损伤模型。实验分为对照组、乙醇摄入组、以及乙醇联合低剂量（50 mM）或高剂量（150 mM）丙酸钠干预组。在细胞实验中，使用小鼠肝细胞系AML-12，建立乙醇（200 mM）和油酸（OA，0.5 mM）共处理模型，并给予丙酸盐（1或2 mM）干预。研究评估了肝脏功能血清学指标（ALT、AST）、肝脏组织病理学（H&E和油红O染色）、肝脏及血清脂质水平（TC、TG、HDL-C、LDL-C）以及氧化应激指标（SOD、CAT、GSH、MDA）。通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测了多种与脂质代谢（ACC1、SREBP-1、CPT1A）和氧化应激（CYP2E1）相关蛋白的表达。核心机制探索采用了整合多组学策略：利用TMT标记的定量蛋白质组学分析肝脏蛋白表达谱，通过非靶向代谢组学分析肝脏代谢物变化，并进行了生物信息学分析（GO、KEGG富集分析，PPI网络构建）。此外，还通过分子对接模拟了丙酸盐与候选靶点蛋白Regucalcin（RGN）的相互作用。
丙酸盐改善ALD小鼠肝脏脂肪变性
在急性ALD小鼠模型中，丙酸盐干预显著降低了因酒精摄入而升高的血清ALT和AST水平，表明其具有肝保护作用。肝脏H&E和油红O染色显示，酒精摄入导致肝脏脂滴沉积显著增加，而丙酸盐处理明显减轻了这种脂质积累。与此一致，丙酸盐补充显著降低了ALD小鼠肝脏中的总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，并改善了血清TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。蛋白质印迹分析进一步证实，丙酸盐处理导致肝脏中脂质合成相关蛋白（ACC1和SREBP-1）表达下调，同时上调了脂质氧化关键蛋白CPT1A的表达。这些发现表明，丙酸盐通过改善紊乱的肝脏脂质代谢，对急性ALD小鼠产生有益作用。
丙酸盐在体外减轻脂质代谢紊乱
在AML-12肝细胞中，乙醇和OA共处理可有效诱导细胞损伤和脂质积累。丙酸盐干预以剂量依赖的方式提高了乙醇/OA共处理细胞的活力，并抑制了细胞内脂滴的形成。同样，丙酸盐补充有效逆转了乙醇/OA共处理引起的ACC1和SREBP-1表达上调以及CPT1A表达抑制。这些结果进一步表明，丙酸盐能在乙醇/OA共处理的肝细胞中恢复脂质代谢平衡。
丙酸盐抑制ALD小鼠肝脏氧化应激
氧化应激在酒精性肝损伤的发病机制中起关键作用。评估发现，酒精摄入导致小鼠肝脏中关键抗氧化剂超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）水平显著降低，同时脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量增加。然而，丙酸盐处理逆转了这些酒精诱导的改变。此外，酒精诱导的细胞色素P450 2E1（CYP2E1）表达增加在丙酸盐干预后也有所降低，这暗示肝脏活性氧（ROS）生成可能随之减少。这些结果表明，丙酸盐通过减轻肝脏氧化应激来保护ALD小鼠的肝损伤。
丙酸盐改变ALD小鼠肝脏蛋白质组谱
通过TMT定量蛋白质组学分析，在对照组与乙醇组之间鉴定出505个差异表达蛋白（DEPs）。与乙醇组相比，丙酸盐处理组显示出112个DEPs（47个上调，75个下调）。基因本体（GO）分析显示，丙酸盐引起的DEPs在羧酸代谢过程、对有毒物质和产热的反应等生物过程中显著富集，这些主要涉及脂质代谢、能量消耗和氧化应激。在分子功能类别中，辅因子结合和氧化还原酶活性是前两大富集功能，与能量代谢和氧化应激密切相关。KEGG通路富集分析进一步揭示，丙酸盐处理后，脂质分解代谢通路（如PPAR信号通路和脂肪酸降解）被上调，而与氧化应激和异生物质代谢相关的通路（如谷胱甘肽代谢和细胞色素P450对异生物质的代谢）则显著下调。对特定通路相关蛋白的热图分析显示，丙酸盐处理后，脂肪酸降解（如Lipa、RGN、Bdh1、Decr1、Cpt1a、Hadha、Etfdh）和PPAR信号通路（如Cyp4a12a、Cyp4a12b、Dbi、Ppara）的大多数成员丰度增加。在氧化应激相关通路中，丙酸盐显著增加了抗氧化相关蛋白（如Prdx5、RGN、Glo1、Prdx2）的表达，同时显著降低了与解毒相关的蛋白（如Gstm2、Gstm5、Cbr）。这些数据表明，丙酸盐通过协调上调脂质利用（包括脂解和脂肪酸氧化）和抗氧化能力，双重缓解酒精性肝损伤。
丙酸盐改变ALD小鼠肝脏代谢组谱
非靶向代谢组学分析显示，丙酸盐处理显著改变了ALD小鼠肝脏的代谢物谱。在正负离子模式下，丙酸盐处理组与乙醇组相比，分别鉴定出14个和55个差异表达代谢物（DEMs）。这些DEMs主要属于脂质/类脂分子和有机酸/衍生物。KEGG通路富集分析表明，受丙酸盐调节最显著的通路包括甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成和cAMP信号通路。代谢物集富集分析进一步指出，丙酸盐处理改变最显著的通路主要与脂质代谢相关，如脂肪酸代谢、降解和生物合成。值得注意的是，酒精代谢的直接标志物乙基葡萄糖醛酸酯和乙基硫酸盐在丙酸盐处理组中均减少，表明酒精及其有毒代谢物的清除加速。有趣的是，几种脂肪酸（十五烷酸、棕榈酸、肉豆蔻酸）在丙酸盐处理的ALD小鼠肝脏中显著增加，这可能源于增强的脂解作用。相关性和网络分析显示，丙酸盐改变的代谢物主要与脂肪酸和磷脂代谢相关，其中十五烷酸是与其他差异代谢物相关性最强的中心枢纽。这些代谢组学发现强化了丙酸盐通过调节脂质代谢改善ALD的假说。
蛋白质组与代谢组整合分析
整合分析显示，丙酸盐处理引起的DEPs和DEMs共同富集于36条KEGG通路，其中辅因子生物合成、药物代谢和胆汁分泌是分子数量最多的前10条通路。胆固醇代谢和花生四烯酸代谢显示出特别显著的富集。相关热图分析进一步揭示，参与脂解通路和PPARα信号传导的几种蛋白质（如Lipa、RGN、Cyp4a12a、Cyp4a12b、Dbi）与脂肪酸代谢物（如棕榈酸、十五烷酸、肉豆蔻酸）呈正相关。这些结果表明，丙酸盐可能通过协调蛋白质表达和代谢物积累（尤其是参与脂质代谢的部分）来恢复肝脏代谢稳态。
丙酸盐上调ALD小鼠的RGN-PPARα信号
为确定丙酸盐调控的关键靶点，研究分析了酒精暴露后下调最显著的蛋白质以及丙酸盐处理后上调最显著的蛋白质。酒精暴露显著抑制了Mup1、RGN和Mup3的表达，而丙酸盐处理则显著上调了它们的水平。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析进一步将RGN、Cyp4a12a、Mup3、Cyp3a11和Otc识别为网络中的中心节点。鉴于RGN在激活PPARα信号和缓解氧化应激中的已知作用，研究假设丙酸盐可能通过靶向RGN发挥其肝保护作用。分子对接模型显示，丙酸盐可与RGN蛋白的活性口袋结合，与多个残基（包括Asn154、Asn103、Met118、Arg101）形成氢键，表明两者之间存在稳定且特异性的相互作用。随后，在肝脏组织中的检测证实，丙酸盐处理完全逆转了酒精诱导的RGN水平下降。此外，丙酸盐干预显著增加了RGN调控的PPARα通路关键组分（PPARα、ACOX1和p-AMPK）的表达。综上所述，这些结果表明丙酸盐可能激活RGN-PPARα信号通路，进而调节脂质代谢并减轻酒精性肝损伤小鼠的氧化应激。
讨论
丙酸盐是一种源自肠道微生物群的关键代谢物，本研究通过整合多组学分析，证明丙酸盐对ALD具有直接的肝保护作用，其机制可能通过激活RGN-PPARα信号通路，协同纠正脂质代谢紊乱并减轻氧化应激。ALD的发病机制核心是肝脏脂质代谢功能障碍和氧化应激的协同作用。本研究提供了直接证据，表明丙酸盐干预在多个层面打破了这一恶性循环。一方面，丙酸盐显著改善了ALD小鼠的肝脏脂肪变性，恢复了代谢调节因子的表达。另一方面，丙酸盐强力减轻了肝脏氧化应激，标准化了关键抗氧化剂的水平并减少了脂质过氧化产物。蛋白质组和代谢组数据进一步阐明了丙酸盐在脂质代谢和氧化应激通路中的调节作用。丙酸盐处理显著诱导了一批参与脂解和线粒体β-脂肪酸氧化的蛋白质。相应的代谢组学分析显示，丙酸盐广泛影响了ALD小鼠的脂质代谢通路。一个有趣的发现是，几种中长链脂肪酸的肝脏含量在丙酸盐处理后显著增加，这可能反映了Lipa驱动的脂解通量激增，暂时增加了β-氧化的底物池。同时，蛋白质组谱分析表明肝脏抗氧化防御在蛋白水平上显著上调。综合来看，丙酸盐通过同时刺激脂解、增强线粒体β-氧化和强化细胞抗氧化能力，重塑了肝脏脂质代谢。这种协调反应促进了代谢从脂毒性脂质储存向持续脂质代谢稳态的转变。机制上，本研究进一步证明丙酸盐对脂质稳态的这种调节与激活RGN-PPARα信号轴有关。PPARα在肝脏脂质稳态中起核心作用，其在ALD中的抑制会导致脂肪酸氧化减少、脂肪新生增强以及随之而来的肝脏脂肪变性。钙调蛋白（RGN）已被报道参与PPARα的激活。本研究中，RGN蛋白水平在酒精暴露后显著降低，并在丙酸盐处理后得到强劲恢复。分子对接和PPI网络分析进一步支持RGN是丙酸盐在ALD中的一个相关靶点。因此，有理由相信丙酸盐至少部分地通过调节RGN来激活PPARα信号通路，从而缓解ALD。与此一致，本研究结果显示丙酸盐处理增加了ALD小鼠肝脏中RGN、p-AMPK、PPARα、ACOX1和CPT1A的表达。这些发现确立了RGN-PPARα信号轴是丙酸盐发挥其肝保护作用的关键通路，同时也凸显了基于丙酸盐的饮食策略作为未来ALD管理实用途径的潜力。
结论
本研究证明，丙酸盐干预重塑了肝脏蛋白质组和代谢组谱，同时促进脂解、增强线粒体β-氧化并强化抗氧化防御，从而在急性ALD模型中改善肝损伤。机制上，丙酸盐处理特异性上调了肝脏组织中RGN的表达，通过增加p-AMPK、PPARα、ACOX1和CPT1A的水平，导致下游PPARα信号通路的激活。这些发现不仅增进了对丙酸盐肝脏保护机制的理解，也突出了丙酸盐作为ALD治疗候选物的潜力。
