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本研究旨在探讨常规骶骨脊索瘤中，通过全外显子组测序(WES)、免疫组化(IHC)和定量核形态计量学，整合评估肿瘤突变负荷(TMB)与细胞核多形性、免疫表型之间的关联。研究纳入了12名成年患者的26份样本，结果显示，常规组织学检查在无复发与多发性长期复发/转移组间未见一致差异，但形态计量学揭示了显著的纵向核重塑，表现为核面积增大、不对称性增加及形状改变。后续复发性患者的原发肿瘤，其细胞核更小、更不对称且密度更高。复发病例的Ki-67指数更高，核纤层蛋白A/C(lamin A/C)表达降低。整体肿瘤突变负荷(TMB)较低，但在复发病例中有升高趋势。结论指出，定量核形态计量学结合免疫表型和基因组学分析，能够捕捉脊索瘤复发相关的表型重塑，为未来数字病理学或人工智能(AI)方法的定量评估框架提供了基础。
1. 引言
脊索瘤是一种罕见的恶性骨肿瘤，好发于中轴骨和颅底。肿瘤发生机制尚未完全明确，推测可能源于成人未分化的脊索残余细胞或良性脊索细胞肿瘤(BNCT)。组织学上分为常规型、去分化型和低分化型。常规型脊索瘤通常由黏液样间质中的液滴状细胞构成，并由纤维间隔分隔为小叶。尽管脊索瘤生长缓慢，生物学上可被视为低级别肿瘤，但其高达65%的多灶性复发率和转移风险使其在侵袭性上可与肉瘤相提并论。
细胞核和核仁在形态结构上的多形性变化，以及组织结构的变化，是实体肿瘤进展或复发的特征，已被公认为肿瘤分级的关键标准，但定性评估常存在较高的观察者间差异。因此，在包括乳腺癌、尿路上皮肿瘤、恶性黑色素瘤、结直肠癌、黏液样脂肪肉瘤、套细胞淋巴瘤在内的多种恶性肿瘤中，已确立组织病理学发现的定量分析作为补充诊断工具。形态计量学已成功用于区分甲状腺良恶性病变。多项研究评估了其他实体肿瘤复发或转移中的核调控失调。在局部复发的软组织肉瘤中观察到基于核形态计量学的组织学分级变化。此外，核形态计量学已被应用于预测骨肉瘤和乳腺导管原位癌的复发，以及区分肾母细胞瘤的原发和转移病灶。然而，尽管核多形性已被讨论为常规脊索瘤的预后因素，但目前尚未发表专门针对复发性脊索瘤的形态计量学研究。
组织学异常是恶性肿瘤组织病理学诊断的主要标准，需考虑细胞核的大小、形状、染色质结构及外核膜不规则性。然而，研究很少将形态学异常与分子遗传学改变相结合。肉瘤的肿瘤突变负荷(TMB)通常低于其他癌。此外，癌在复发和转移中可以表现出显著的基因组进化。相比之下，对于脊索瘤等其他中胚层肿瘤的长期基因组进化知之甚少。具体而言，目前尚不清楚肿瘤突变负荷(TMB)和其他突变积累指标是否与复发性脊索瘤中核形态计量学和免疫表型的可重复性变化相关。
本研究调查了长期复发性与非复发性脊索瘤中，组织学与免疫组化发现、定量核多形性与分子突变负荷指标（特别是TMB）之间的关联，并提出以下问题：无复发肿瘤的形态计量参数是否存在显著差异？具有多发性长期复发和/或转移的肿瘤是否随时间推移显示出可测量的多形性变化？核膜关键丝状蛋白核纤层蛋白A/C(lamin A/C)的水平是否相应变化？后续发生复发的患者的原发肿瘤在基线时是否与无复发肿瘤不同？核形态计量变化是否与突变负荷的分子指标（特别是TMB）相关？研究目标是通过描述核形态与遗传改变之间的关系，来刻画随时间的形态计量、免疫表型和分子进化，从而促进对脊索瘤复发发展的更全面理解。这些发现有望为治疗方案提供见解，并为未来研究长期复发性脊索瘤的治疗脆弱性提供信息。
2. 材料与方法
2.1. 样本选择
这是一项描述性病例系列研究，样本来自无复发性脊索瘤患者以及具有多发性长期复发和/或转移的患者，评估了其组织学特征、免疫组化谱、核多形性和TMB。从德国马格德堡奥托·冯·格里克大学病理学研究所骨肿瘤登记处的组织病理学档案中，共检索了12名患者的26份福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织样本。其中8名患者患有未复发的原发肿瘤，4名患者出现了多发性长期复发和/或转移。研究开始时，8名无复发患者中有7名已去世，其余1名患者随访了6年。临床数据由骨科和放疗科提供。汇总于图1的临床数据包括年龄、性别、肿瘤部位、治疗方案（放疗/化疗）以及长期复发的时间（如可获得）。本研究获得了德国马格德堡奥托·冯·格里克大学医学院伦理委员会的批准。
2.2. 组织病理学分析
由经验丰富的骨病理学家审查所有切片，评估组织学，并根据现行《世界卫生组织软组织和骨肿瘤分类》（第5版）对肿瘤进行分类。本研究仅纳入成年患者的常规骶骨脊索瘤。
2.3. 免疫组化
对所有样本进行了免疫组化染色，检测brachyury、Ki-67 (MIB-1)、p53 (DO7)、S100、波形蛋白(vimentin)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、全细胞角蛋白(pancytokeratin, PCK)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、SMARCB1 (INI1)、核纤层蛋白A/C(lamin A/C)、程序性死亡受体-1(PD-1)和程序性死亡配体-1(PD-L1)。评估了染色强度，Ki-67指数通过手动计数每张切片2-6个随机选择的高倍视野（400×）确定，表示为阳性染色肿瘤细胞核的百分比。平均每个样本分析了1764个细胞核。p53指数以类似方式通过手动计数每张切片一个随机视野（200×）确定，表示为强染色肿瘤细胞核的百分比。
2.4. 形态计量学
在H&E染色的切片上，使用NIS Elements D软件在600×放大倍数下，通过系统视野选择法测量细胞核，平均每个样本测量317±15个细胞核。在低倍镜下确定代表性肿瘤区域后，通过以预定步进模式移动显微镜载物台（交叉表格）在肿瘤区域上选择视野，避开坏死、出血或有伪影的区域。在每个选定视野内，使用鼠标在数字捕获的图像上手动追踪肿瘤细胞核。至少追踪每个样本300个细胞核。核形态计量参数评估了除核面积外的尺寸、形状、纹理和密度描述符。方法学框架借鉴了Khatri等人使用形态计量学分析区分甲状腺良恶性病变的方法。
2.5. 全外显子组测序
全外显子组测序(WES)被广泛用于确定TMB，并提供比靶向panel更广泛的基因组覆盖范围。TMB通常定义为每兆碱基可编码序列中非同义体细胞变异数量。因此，本队列的突变谱通过WES进行分析。在DNA提取前，由经验丰富的病理学家在2μm H&E染色FFPE切片上标记肿瘤区域，并在100×放大倍数下使用显微镜在6μm切片上追踪。标记组织在脱蜡前进行宏切割。使用DNA纯化试剂盒分离DNA。提取的DNA经定量后，使用SureSelect XT HS2 DNA系统进行DNA文库制备和靶向富集，使用Illumina平台进行酶切片段化、文库制备、杂交捕获以及用于多重测序的捕获后样品处理。DNA质量在流程步骤之间定期评估。捕获的文库在测序前于-20℃保存，测序在德国马格德堡大学医院人类遗传学研究所的Illumina NextSeq? 550平台上进行。
测序数据使用Varvis? 流程进行处理，比对到GRCh37参考基因组进行变异检测。应用了过滤器以减少低水平亚克隆检出：次要等位基因频率(MAF) Gnom total <0.001，变异等位基因频率(VAF) ≥0.1，reads-index ≥ 40，影响程度“高”或“中等”，AltAF index ≥ 0.15。排除了不改变蛋白质产物的氨基酸变化（同义变异）。使用dbSNP和内部Varvis数据库过滤假定的种系多态性。在内部数据库中条目数≥100的变异被排除。TMB计算为每35 Mb可编码外显子序列中非同义SNV + InDel的数量。
2.6. 统计分析
所有统计分析均使用MATLAB和Microsoft Excel进行。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，并辅以单个直方图和Q-Q图的目视检查。使用Levene检验评估方差齐性并用箱线图可视化。由于每个样本测量了多个细胞核，因此将样本定义为主要的统计单位。样本水平的测量值汇总为样本水平的中位数。无复发肿瘤间的肿瘤间变异性通过范围、四分位距(IQR)和肿瘤间变异系数进行描述性评估。鉴于每个无复发病例只有一个样本可用，未在个体无复发病例之间进行推断性假设检验。复发病例内的变化被视为依赖性测量，并使用非参数重复测量方法（Friedman检验）结合Bonferroni校正的事后成对比较进行探索。鉴于独立患者数量少且时间点数量不等，这些纵向p值被视为探索性。使用Mann-Whitney U检验基于样本水平汇总统计量比较无复发肿瘤(NRTs)与复发病例的原发肿瘤。
形态计量学特征分为四类：尺寸（核面积、等效直径、周长、核面积变异系数）、形状（形状因子、Feret直径）、纹理（粗糙度）和密度（密度、强度、亮度）。对于核尺寸测量，直接测量核面积和周长。核面积变异系数(NACV)计算为（核面积标准差/平均核面积）× 100。形状参数包括形状因子、最小和最大Feret直径，以及旋转90°测量的最大Feret直径(maxFeret90)。形状因子量化物体接近完美圆形的程度，接近1表示高圆形度。计算公式为Formfactor = (4π × 面积) / (周长2)。最小和最大Feret直径描述了应用于核轮廓的两条平行切线之间的最短和最长距离，反映了核的最小和最大扩张。高最大Feret直径和低最小Feret直径提示细长或变形的细胞核。最大Feret90是指垂直于原始最大Feret测量的最大Feret直径。最大Feret和最大Feret90之间的差异提供了核轮廓对称性的估计，差异越大表明不规则性越大。密度参数包括密度和强度（亮度）。总强度表示选定区域内所有像素强度值的总和。总密度（或积分密度）定义为所有测量像素值的累积密度按面积归一化，公式为：Sum Density = ∑(pixel intensity × pixel area)。
