《Microorganisms》：Low Temperature Impacts Root Physiological Characteristics and Related Microbial Community Diversity in the Rhizosphere of Japonica Rice
Zhenyu Liu,
Yan Jia,
Weibin Gong,
Jian Jin,
Shenyan Fu,
Zhijie Luo,
Wenhua Zhou,
Jingguo Wang and
Hongwei Zhao
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本研究通过2023-2024年的田间试验，系统阐明了低温胁迫对粳稻根系形态生理（如总根长、根系氧化活性、木质部伤流液速率）及根际微生物群落结构的双重抑制效应。研究发现，分蘖期与孕穗期复合胁迫（T3）损害最重，品种间耐冷性差异显著（DN428 > SJ10）。低温还改变了土壤养分（如提升有机质SOM、总氮TN，降低有效磷AP、速效钾AK）并重塑了微生物功能（如上调“代谢通路”）。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），鉴定出lacZ、fucK、rafA等关键基因为调控品种特异性冷响应的核心。结构方程模型（SEM）进一步揭示了耐冷品种（DN428）的减产主要与微生物功能基因表达受抑相关，而冷敏感品种（SJ10）则与微生物群落多样性及功能潜力的广泛下降有关。研究最终提出了一个“基因-微生物-功能”整合模型，为通过优化根-土-微生物互作以提升粳稻耐冷性提供了新策略。
引言：低温胁迫对粳稻生产的影响与“基因-微生物-功能”研究框架
低温胁迫是限制水稻生产的主要非生物胁迫之一，深刻影响其产量表现和地理分布。作为全球最重要的主粮作物之一，水稻的生长高度依赖适宜的气象条件，并对温度波动极为敏感。在气候变化背景下，极端低温事件在水稻生长发育期间持续发生的风险增加，尤其是在中高纬度地区。现有研究多关注单一生长阶段（如营养生长期的分蘖阶段或生殖生长期的孕穗/抽穗阶段）低温胁迫的影响，但对于跨分蘖期与孕穗期的复合低温胁迫效应知之甚少。同时，根系作为植物的“大脑”和“引擎”，其形态、结构和功能在低温下会受到多方面的抑制，而根际微生物在土壤-植物互作中扮演着关键角色。然而，将粳稻根系形态生理特征与根际微生物功能基因组学在连续低温胁迫下进行整合的研究较少。本研究旨在填补这些知识空白，提出了“基因-微生物-功能”联动假说，即胁迫诱导的根系分泌物变化促进特定微生物类群的富集，这些类群内功能基因的表达进而调控根系生理响应，最终影响植株表现。本研究通过比较不同耐冷性粳稻品种（耐冷型DN428和冷敏感型SJ10），系统探究了分蘖期（T1）、孕穗期（T2）及两期复合（T3）低温胁迫对根系性状、根际土壤性质、微生物群落结构及功能的影响，并利用WGCNA和SEM识别关键调控基因与通路，以阐明品种依赖性减产机制。
材料与方法：试验设计、测定指标与生物信息学分析
本研究在位于黑龙江省哈尔滨市的东北农业大学阿城实验实习基地（北纬45°44′–46°38′，东经126°15′–127°30′）进行，试验时间为2023年和2024年的4月至9月初。供试材料为两个粳稻基因型：具有中等耐冷性的DN428和耐冷性较低的SJ10。试验采用裂区设计，主区因素为低温处理，副区因素为品种，设置三次重复。低温处理通过智能温控系统进行冷水灌溉实现：分蘖期处理（T1）水温维持在15±0.5°C，孕穗期处理（T2）水温维持在17±0.5°C，各处理持续7天；T3处理则为分蘖期和孕穗期均进行处理。以常温灌溉作为对照（CK）。
测定指标主要包括：1) 根系形态与生理性状：在每次低温处理结束当天取样，测定总根长、根表面积、根体积、根系氧化活性（α-萘胺法）和木质部伤流液速率。2) 根系氮积累、生物量与产量：在关键生长阶段取样测定植株生物量、根系氮含量（CN分析仪）及产量构成因素。3) 根际土壤样品采集与理化性质：在分蘖期、减数分裂期、齐穗期和成熟期共四个时间点采集根际土壤，测定土壤pH、有机质（SOM）、全氮（TN）、全磷（TP）、有效磷（AP）和速效钾（AK）含量。4) 土壤宏基因组测序：对78份土壤样本进行DNA提取、文库构建和Illumina NovaSeq 6000测序。进行序列质量控制、基因组组装、基因预测与功能注释（基于NCBI NR和KEGG数据库）。计算Alpha多样性指数（如Shannon、Chao1）和Beta多样性（基于Bray-Curtis距离的主坐标分析PCoA）。5) 数据分析：采用三因素方差分析（年份×品种×处理）评估处理效应。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与根系性状及土壤养分显著相关的基因模块和枢纽基因。通过结构方程模型（SEM）构建品种特异的低温致减产路径模型。
结果
3.1 根系形态生理性状、氮积累与生物量
低温处理显著抑制了两个水稻品种的根系生长和生理活性。三因素方差分析表明，品种（V）和处理（T）对所有测定根系性状的主效应均极显著，而年份（Y）效应及多数交互作用不显著。与对照相比，T3处理的抑制作用最强，其次是T1和T2。SJ10对低温处理的敏感性始终高于DN428，所有根系性状的下降幅度更大。例如，在T3处理下，SJ10的根长、根系氧化活性、木质部伤流液速率、根系氮积累和生物量的冷响应指数（CRI，相对于对照的百分比）分别比DN428低3.6–18.0%、2.4–8.1%、5.1–18.1%、5.1–17.7%和3.9–15.8%。
3.2 低温处理对水稻产量及产量构成的影响
产量及其构成因素受处理和品种的显著影响，但不受年份影响。与对照相比，DN428和SJ10的有效穗数在T2处理下无显著差异，但在T1和T3下显著下降。千粒重在T2和T3下下降，在T1下无变化。每穗粒数、结实率和产量在低温处理下均显著下降，下降幅度顺序为T3 > T2 > T1。SJ10表现出更高的敏感性，其减产幅度比DN428大4.0–5.3%。
3.3 低温处理对土壤pH和养分含量的影响
与对照相比，DN428和SJ10根际土壤的SOM、TN和TP含量在低温处理下增加；AP和AK显著下降，而pH在所有生长阶段均无显著差异。这些变化的幅度呈处理依赖性，顺序为T3 > T2 > T1。值得注意的是，与DN428相比，SJ10在成熟期对TP、SOM、AK和AP的下降幅度更大。
3.4 低温处理下水稻根际微生物的宏基因组分析
3.4.1 土壤Alpha多样性
根际微生物群落的Alpha多样性以阶段特异性方式响应低温处理。群落丰富度（ACE指数）在所有生长阶段保持相对稳定。相比之下，群落多样性（Shannon和Simpson指数）在齐穗期最易受影响，在胁迫下显著降低（例如，SJ10-T3的Shannon指数比对照降低约15%）。在成熟期，Alpha多样性指数的处理效应不再显著。
3.4.2 土壤Beta多样性
Beta多样性分析揭示了处理与对照之间的显著分离，尤其是在T3处理下。在所有生长阶段都观察到了微生物群落组成的显著变化。在齐穗期，DN428在T2处理下与对照的微生物组成无显著差异，但T1和T3处理引起了显著偏离。对于SJ10，T1和T2之间无显著差异，但两者都与T3不同。
3.4.3 微生物物种组成
在门水平上，Anaerolinea在所有生长阶段样本中占主导地位。此外，几个关键类群的相对丰度在处理下发生变化。例如，在分蘖期，两个品种的Arthrobacter丰度在T1处理下相比对照显著下降。在齐穗期，SJ10中Arthrobacter的相对丰度在T1和T2下显著下降，但在T3下不显著。
3.4.4 微生物特征与植物和土壤参数的联系
混合效应模型表明，Actinomycetota和Euryarchaeota与根长、根表面积、根体积和木质部伤流液速率显著正相关。相反，Thermodesulfobacteriota对根系性状有显著的负面影响。Alpha多样性指数与根系形态生理性状无显著关联。Actinomycetota显著抑制了TN和TP，同时显著提高了AK和AP。而Thermodesulfobacteriota则表现出相反的模式。
冗余分析（RDA）确定AK和AP是所有生长阶段塑造微生物群落结构的主导因素。Spearman相关性分析评估了品种和处理特异性关联。在DN428处理组中，几个门（如Pseudomonadota和Cyanobacteriota）与TN和TP呈正相关。SJ10的对照组中，Verrucomicrobiota始终与TN、TP和AP呈负相关。
3.4.5 微生物群落的预测功能谱
在分蘖期和成熟期，“代谢途径”是主导的代谢通路。在减数分裂期，“氨基酸的生物合成”、“辅因子的生物合成”和“群体感应”通路在品种间存在显著差异。在齐穗期，“碳代谢”和“双组分系统”是关键通路。与对照相比，“双组分系统”通路的相对丰度在DN428的低温处理下下降，但在SJ10中上升。
3.4.6 微生物相关性网络分析
在DN428处理组中，前15个最丰富的门之间发现了62个显著相关性，Chloroflexota和Candidatus Rokubacteria是关键连接子。在DN428对照组中观察到110个显著相关性，Actinomycetota、Thermodesulfobacteriota、Pseudomonadota和Acidobacteriota是主要枢纽。SJ10处理组的连接较少（42个），对照组有56个连接。这表明低温处理加强了Chloroflexota的网络作用，但削弱了Pseudomonadota和Actinomycetota的作用。
3.5 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
3.5.1 与根系性状相关的模块和枢纽基因
对宏基因组数据和根系性状进行WGCNA，识别出28个基因模块。相关性分析显示，MEbrown模块与根系氧化活性呈中度正相关。MEdarkturquoise模块与根表面积呈弱但显著的负相关。在MEbrown模块中，枢纽基因包括susC、lacZ (K01190)、fucK (K00879)、susD、E3.2.1.22B、galA、rafA (K07407)和K09955。在MEdarkturquoise模块中，关键基因是BEST (K22204)、KCNQ1, KV7.1 (K04926)、LRRN1_2_3 (K24492)、TEX11 (K24574)和VAV (K05730)。这些基因可能参与低温下根系发育的调控。
3.5.2 与土壤养分相关的模块和枢纽基因
对基因与土壤参数进行WGCNA也得到28个模块。MEblue模块与AP和AK呈强正相关，而MEgreen模块与AP和AK呈负相关。MEblue模块中的枢纽基因（如dnaE2、lhr、ALDH和ligD）和MEgreen模块中的枢纽基因（如wza, gfcE、atoC、cckA、TMTC和zraS, hydH）可能参与胁迫响应和养分循环调控。
3.6 低温处理下导致减产的整合路径
结构方程模型（SEM）描绘了品种特异性路径。对于DN428，主要路径始于孕穗期（T2）和复合期（T3）的低温处理。这些处理显著影响了土壤微生物群落的α多样性，进而影响了土壤有机质（SOM）含量。这一级联效应最终损害了根系生理和氮积累，导致减产。
对于SJ10，路径更为复杂，涉及关键微生物基因。分蘖期的T1处理对关键微生物基因（如fucK、lacZ、rafA）的表达产生了显著的直接负效应。同时，T2和T3处理显著改变了微生物群落丰富度。这些不同的路径汇聚于一个关键节点：降低了土壤有效磷（AP）的有效性，进而强烈抑制了根系活性，最终导致严重的减产。
讨论
4.1 低温损害根系功能并限制产量
低温在两个发育阶段都显著抑制了根系形态和生理性状，这与之前的研究结果一致。然而，品种间耐冷性差异明显。具体而言，耐冷品种DN428在低温处理下根系形态生理性状的下降幅度小于SJ10，表明DN428保持了更优的根系形态，从而能更有效地将水分和养分运输到地上部。本研究还观察到，即使在后期生长阶段，经历低温处理的植株其根系形态生理性状仍低于正常条件。这表明低温处理不仅直接抑制了关键阶段的根系生长和伸长，还加速了后续阶段的根系衰老。最终，根系运输功能的减弱限制了对地上部的养分和水分供应，损害了光合作用，减少了碳水化合物向根部的回流，并削弱了根系呼吸，共同加速了根系老化。这一系列效应凸显了低温对寒地粳稻根系发育的长期不利影响。
低温处理是限制水稻产量的主要因素，对实现高产稳产构成重大障碍。本研究中，低温处理对不同处理产生了不同的影响。与对照相比，T2的有效穗数无显著差异，而T1和T3则大幅减少。T1对千粒重的影响可忽略不计；然而，在T2和T3下观察到显著下降。此外，低温处理导致耐冷粳稻品种DN428的每穗粒数、结实率和理论产量下降，尽管下降幅度小于SJ10。
4.2 低温改变根际养分有效性
本研究揭示了低温胁迫引起的土壤pH和养分含量变化，为理解水稻品种特异的生理和微生物响应机制提供了关键的土壤环境证据。所有处理组表现出一致的模式：SOM、TN和TP含量显著增加，同时AP和AK含量显著下降。这表明低温处理下的根际环境正从矿化主导状态向养分固定化转变。这种转变可能源于低温对微生物活性和胞外酶活性的抑制。根际微生物活性的降低延迟了有机底物的分解，从而阻碍了土壤养分向植物可利用形态的转化。这最终限制了水稻关键生长阶段的养分有效性。此外，在整个采样期间，AK和AP成为微生物群落动态的关键驱动因素。这与先前的研究结论一致，即铵态氮（AN）和AP是根际微生物群落变异的核心驱动因素。
值得注意的是，本研究观察到低温诱导了土壤中TN的积累，而其他长期冷胁迫研究报告了TN的消耗。这种明显的矛盾可能源于不同的试验持续时间和强度：短期或周期性寒冷主要抑制微生物矿化，导致TN以有机形式固定；而长期、持续的寒冷可能完全抑制微生物生物量和固氮作用，导致净TN消耗。此外，水稻品种通过改变根系分泌物组成等途径差异性地调节土壤固氮和转化过程。初始土壤理化性质（如质地、有机质含量）强烈介导低温下的养分循环响应。这表明低温通过微生物过程和植物-微生物互作在特定环境背景下的联合效应来影响土壤氮库。
观察到的跨处理组的梯度响应（在T3下尤为明显）与逐渐受抑制的根系形态生理性状密切相关。T2和T3处理下SOM和TN的显著积累可能反映了根系养分吸收能力下降和微生物代谢活动减弱，导致有机化合物保留在土壤中。相反，AP和AK的下降则预示着养分供应限制的出现，可能加剧了两个水稻品种观察
