《Microorganisms》：Screening, Safety Assessment, and Process Optimization of Lactic Acid Bacteria from Traditional Yak Yogurt as Adjunct Cultures
Weiming Shuang,
Xiaodong Zeng,
Ting Li,
Jing Li,
Qing Sun and
Lianhong Chen
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本文综述了一项通过接种木聚糖降解微生物复合菌剂（MC1）和商业菌剂（BS1）来提升牛粪-玉米秸秆堆肥效率的研究。研究发现，MC1菌剂能更有效地促进木聚糖组分（纤维素、半纤维素、木质素）的降解，并富集了关键功能微生物（如子囊菌门Ascomycota、厚壁菌门Firmicutes），从而显著加速了堆肥进程，为改善农业废弃物堆肥的效率和可持续性提供了理论依据。
1. 引言
随着畜牧养殖业的快速扩张，畜禽粪便的处理与资源化利用成为农业可持续发展的重大挑战。全球每年产生近63亿吨畜禽粪便，其中中国的牛粪年产量就高达13.8亿吨，占总量的五分之一以上。目前，这些废物的处置主要依靠堆放，极易造成严重的水、土、气污染。因此，有效管理牛粪对推动中国畜牧业发展至关重要。好氧堆肥是牛粪资源化利用的重要途径，能够促进粪便堆肥中木聚糖的降解，并将其转化为腐殖质和养分。然而，牛粪和玉米秸秆中都含有大量难降解的有机碳成分，如木聚糖组分——半纤维素、纤维素和木质素。作为木聚糖的主要成分，纤维素和半纤维素的降解因其分子间存在牢固的氢键，形成高结晶度、高强度、高化学稳定性的化合物，是制约生物堆肥大规模工业化应用的主要瓶颈，也是影响堆肥周期最主要的限速步骤。因此，强化木聚糖的生物降解对于提高堆肥质量和效率具有重要意义。
在外源微生物接种方面，已有研究表明，在牛粪堆肥中引入外源微生物可以增加木聚糖降解微生物的多样性和丰度，刺激微生物活性，加速木聚糖的生物降解，并提高堆肥腐熟度和质量。此外，外源微生物接种还能减少臭气排放，有效抑制有害微生物的增殖，使堆肥过程更加环保和卫生。近年来，真菌和细菌对木聚糖的降解日益受到关注。真菌是木聚糖酶的主要生产者，而细菌通常生长更快，且相关酶的热耐受性更强。多项研究已筛选出多种可促进纤维素降解的微生物，将这些特定的功能微生物应用于堆肥，可有效促进木聚糖的分解。虽然大量研究证明了外源微生物接种在提高堆肥效率和木聚糖降解方面的益处，但多数研究集中于单一微生物菌株或商业菌剂，针对自行研发的木聚糖降解微生物菌剂与商业微生物菌剂的对比分析仍很有限。此外，将微生物群落演替与整个堆肥过程中纤维素、半纤维素和木质素降解动态联系起来的研究也相对匮乏。因此，本研究旨在评估不同微生物菌剂在牛粪堆肥过程中对木聚糖降解和微生物群落动态的影响，以期为优化微生物接种策略、提高堆肥质量和效率提供参考。
2. 材料与方法
堆肥实验在位于温带半湿润气候区的延边大学进行。将新鲜牛粪与玉米秸秆按质量比3:1混合并充分均质，作为堆肥原料。实验设置三个处理组：非接种对照组(CK)和两个接种处理组，分别接种木聚糖降解微生物复合菌剂(MC1)或商业微生物菌剂(BS1)。木聚糖降解菌剂MC1主要由变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、担子菌门(Basidiomycota)和放线菌门(Actinobacteria)的成员组成。商业菌剂BS1包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, >1×1010CFU g-1)和酵母(>3×109CFU g-1)。对于接种处理，在每个堆体中添加2公斤麦麸作为载体以激活微生物，然后分别添加MC1菌液或BS1菌剂并充分混匀。
每个处理的堆肥分别在一个体积为2 m3、高约1米的独立堆体中进行自然发酵。当堆体温度达到50°C时，每隔2天进行人工翻堆；温度降至35°C后，每隔5天翻堆一次。整个堆肥过程持续49天，并在第0天（开始）、第21天（高温期）和第49天（腐熟期）取样。每日中午测量堆体内部和环境温度。对样品的pH、电导率(EC)、有机质(OM)含量、总氮(TN)、总磷(TP)、总钾(TK)、铵态氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)以及纤维素、半纤维素、木质素含量进行测定。此外，还提取了堆肥样品的总基因组DNA，对细菌16S rRNA基因的V3-V4区和真菌ITS区进行扩增和高通量测序，以分析微生物群落动态。
3. 结果
3.1. 堆肥过程中的温度变化
结果显示，接种外源微生物的处理组(MC1, BS1)性能优于对照组(CK)。在堆肥升温期（约0-7天），各处理组温度均迅速上升。MC1处理组在第6天进入高温期(>50°C)，持续31天；BS1处理组在第7天进入高温期(7-37天)，持续30天。MC1和BS1处理组均在37天后进入降温期，比CK组早两天。MC1处理组比BS1处理组更快进入高温期，且持续时间更长。
3.2. 堆肥过程中的理化性质变化
在整个堆肥过程中，各处理组的理化指标呈现系统性变化。pH值呈现先下降后上升的趋势，最终形成弱碱性环境(7.5-8.2)。电导率(EC)先升后降，所有处理在堆肥结束时的EC值均低于4 ms/cm的安全标准。有机质(OM)含量呈先升后降的趋势，MC1处理的OM分解率最高，达到BS1处理的1.44倍和CK对照的2.48倍。碳氮比(C/N)持续下降，在堆肥结束时，MC1和BS1处理的C/N比均降至成熟标准20以下。总氮(TN)含量呈上升趋势，总磷(TP)含量动态增加，而总钾(TK)含量先升后降并逐渐稳定。铵态氮(NH4+-N)含量先升后降，硝态氮(NO3--N)含量先降后升。实验表明，添加MC1显著促进了OM分解，降低了C/N比，并增强了氮、磷等养分的保持和转化。
3.3. 堆肥过程中木聚糖含量的变化
木聚糖含量随着发酵时间的延长呈下降趋势。堆肥结束时（第49天），MC1、BS1和CK组的木聚糖降解率分别为46.25%、37.5%和29.8%。MC1处理组的木聚糖降解率分别是BS1和CK组的1.23倍和1.55倍。纤维素和半纤维素的降解主要发生在升温期和高温期，表明嗜热微生物在其分解中起关键作用。木质素作为一种具有复杂聚合物结构的芳香族化合物，难以被微生物降解。堆肥结束时，纤维素、半纤维素和木质素含量均显著下降。与堆肥前相比，MC1处理分别降低了51.27%、56.23%和41.32%；BS1处理分别降低了66.51%、56.00%和17.07%；CK处理分别降低了33.69%、29.46%和28.65%。在堆肥末期，BS1处理堆的纤维素降解率分别是MC1处理和CK处理的1.3倍和1.97倍；而MC1处理堆的木质素降解率分别是BS1处理和对照堆的1.9倍和1.44倍。
3.4. 微生物群落的门水平组成分析
在整个堆肥过程中，子囊菌门(Ascomycota)是真菌中的优势门。接种MC1和BS1显著提高了子囊菌门的相对丰度。外源微生物的添加同时增加了木聚糖的降解率，这与子囊菌门丰度的增加相伴随，表明子囊菌门可能在堆肥过程中的微生物群落动态中扮演重要角色。此外，厚壁菌门(Firmicutes)在整个堆肥过程中表现出较高的丰度。这些微生物具有耐热和嗜热特性，能在极端环境中生长，并在降解纤维素和半纤维素方面表现出卓越能力。在堆肥升温期和高温期早期（0-21天），子囊菌门内的降解微生物分泌漆酶、锰过氧化物酶和过氧化物酶等胞外氧化酶系统，负责攻击和分解木质素的复杂芳香环结构，从而暴露纤维素和半纤维素，促进了以厚壁菌门为代表的纤维素降解细菌的增殖。在第21天，MC1处理中的子囊菌门丰度最高（44.31%），而BS1和CK处理分别为28.6%和20.84%。在整个堆肥过程中，由于微生物功能转变、底物消耗和温度变化，子囊菌门和担子菌门的丰度均呈下降趋势。
3.5. 微生物群落热图分析
细菌群落与有机质(OM)呈极显著相关，与木聚糖组分（半纤维素-Hcel、纤维素-Cel、木质素-Lig）和电导率(EC)呈显著相关。真菌群落与木聚糖组分呈显著相关。这表明细菌和真菌群落结构随着木聚糖含量的变化而发生相应调整，可能是由于外源接种促进了细菌和真菌对木聚糖的降解，从而影响了群落组成。此外，有机质(OM)与细菌群落高度显著相关，强调了细菌在堆肥过程中有机质积累和转化中的关键作用。纤维素和半纤维素与OM呈显著正相关，这可能与OM作为微生物代谢的能量来源有关。该能量源极大地促进了微生物的富集，导致OM含量降低。因此，降解微生物广泛分解纤维素和半纤维素，使其浓度相应下降。木聚糖组分与总氮(TN)呈显著负相关，这可能与堆肥过程中木聚糖降解有关，其中总氮水平的升高抑制了木聚糖分解酶的合成和活性，从而抑制了木聚糖降解。
3.6. 结构方程模型分析
根据结构方程模型分析，MC1对厚壁菌门(0.62)和子囊菌门(0.72)具有显著的正向驱动作用。BS1也对厚壁菌门(0.42)和子囊菌门(0.35)表现出显著的正向驱动作用，表明外源微生物添加优化了堆体内部的微生物群落结构，促进了子囊菌门和厚壁菌门的富集。然而，MC1显示出比BS1更高的路径系数，表明MC1对厚壁菌门和子囊菌门的影响比BS1更显著。子囊菌门与纤维素(-0.45)、半纤维素(-0.30)和木质素(-0.68)呈显著负相关。在本研究中，木聚糖降解菌剂(MC1)处理中观察到的木质素显著降解与子囊菌门密切相关。在堆肥过程中，子囊菌门的相对丰度呈下降趋势，与木质素含量的持续下降形成显著负相关。厚壁菌门与纤维素(-0.51)和半纤维素(-0.31)呈显著负相关，而对木质素(-0.15)的影响不显著。SEM分析进一步揭示了子囊菌门在纤维素降解中的核心作用。在堆肥过程中，子囊菌门的相对丰度总体呈现先升后降的趋势，与纤维素和半纤维素含量呈显著负相关。路径系数分析表明，子囊菌门主要降解纤维素和半纤维素。总之，在木聚糖降解性能方面，木聚糖降解MC1微生物处理表现优于商用BS1微生物菌剂。
4. 讨论
4.1. 堆肥过程中理化性质的变化
本研究结果表明，外源微生物的施用显著影响堆肥过程中的理化性质，并促进有机质(OM)转化，这与堆肥系统内微生物群落的动态变化密切相关。在整个堆肥过程中，所有处理的pH值在7.5至8.2之间波动，为微生物生长提供了弱碱性环境。各处理的pH值先下降后上升，这与有机酸的产生和氨化作用有关。有机酸的产生抑制了微生物活性，导致H+释放增加和pH下降；相反，氨化作用产生了OH-，导致pH升高。三个处理的有机质含量在堆肥过程中普遍呈现先升后降的趋势。堆肥中有机碳的转化主要涉及三个阶段：降解、CO2释放和微生物固碳。有机质含量的初始增加可能是由于水分流失和易降解组分优先降解导致的浓缩效应。木聚糖降解菌(MC1)的添加显示出比商用微生物菌剂(BS1)更优越的降解效果。MC1处理中有机质降解的增强可能归因于接种微生物具有更高的木聚糖降解能力，这可能加速了纤维素和半纤维素等顽固碳组分的分解。这种加速降解也可能通过增加有机质矿化作用，促进了MC1处理中更高的总氮浓度。对于MC1和BS1组，总氮呈总体上升趋势，有机氮构成堆肥中总氮的主要部分。在分解过程中，有机氮经历矿化和分解。随着无机氮转化为氨和氧化亚氮，总氮含量逐渐减少。有机质矿化产生浓缩效应。随着堆肥过程中堆体质量的减少，总氮浓度通常会增加。
4.2. 堆肥过程中木聚糖的变化
木聚糖是牛粪和玉米秸秆等堆肥原料中有机物的主要部分，本身难以被微生物降解。在堆肥过程中，微生物活动通过分泌胞外酶（包括纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解氧化酶）逐步分解木聚糖组分。随着堆肥的进行，所有处理的木聚糖含量均下降，但不同处理间的降解效率存在显著差异。商业菌剂BS1表现出强大的纤维素降解能力。这种能力可能与枯草芽孢杆菌等产纤维素酶细菌的存在有关，这些细菌分泌纤维素酶，将纤维素水解为可溶性糖。然而，BS1处理中观察到的木质素降解相对较低，表明该微生物菌群缺乏高效的木质素降解微生物，限制了整体的木聚糖降解效率。相比之下，MC1处理显示出更强的木质素降解能力，表明可能存在能够产生木质素分解酶的微生物。在MC1处理中富集的子囊菌门成员，是已知能够产生漆酶和过氧化物酶等催化木质素氧化解聚的酶的生产者。木质素的分解尤为重要，因为木质素形成了包裹纤维素和半纤维素的复杂保护性基质，限制了微生物对这些多糖的接触。因此，MC1处理中高效的木质素解聚可能破坏了这种结构屏障，增加了纤维素和半纤维素对微生物酶的可及性，从而促进了整体木聚糖的转化。这一发现表明，木质素降解是堆肥过程中木聚糖转化的一个关键限速步骤，具有强木质素分解活性的微生物菌群可能会大幅提高堆肥效率。
4.3. 堆肥过程中微生物群落的变化
堆肥是一个动态的、由微生物驱动的生态演替过程，其中微生物群落的转变直接影响有机物转化和堆肥腐熟。先前的研究表明，外源微生物接种可以通过富集特定的功能菌群来重塑微生物群落结构，从而改善降解途径。木聚糖降解菌剂(MC1)在升温和高温期增加了变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度，而商业菌剂(BS1)主要在高温期表现出较高的变形菌门丰度。变形菌门通常在富含有机物的环境中大量存在，常与有机物转化相关，包括纤维素和半纤维素的降解，以及释放支持微生物生长的矿质养分和中间代谢物。许多厚壁菌门成员是兼性或专性厌氧的纤维素分解菌，能够在堆肥系统中常见的微厌氧条件下降解纤维素和半纤维素。它们在升温和高温期相对丰度的增加与基于纤维素的组分快速消耗有关。子囊菌门在整个堆肥过程中是主要的真菌类群。结构方程模型分析表明，与BS1相比，MC1对子囊菌门具有更强的正向影响。子囊菌门的成员被广泛认为是堆肥系统中木质素降解的重要贡献者。这些真菌能够通过分泌漆酶和锰过氧化物酶等木质素分解酶来降解木质素，在本研究中与木质素含量呈显著负相关。有效的木质素降解可以增强纤维素和半纤维素对包括放线菌门成员在内的其他微生物的可及性。总体而言，MC1的添加促进了与木聚糖降解相关的关键功能微生物类群，特别是木质素降解微生物的富集，从而促进了整体木聚糖转化，加速了堆肥腐熟过程。
5. 结论
本研究证明，接种木聚糖降解微生物(MC1)和商业微生物菌剂(BS1)改善了牛粪和玉米秸秆的堆肥性能。在各处理中，MC1在促进木聚糖降解和加速堆肥腐熟方面表现出更优的效果。MC1处理优化了微生物群落结构，特别是通过富集与木聚糖分解和木质素分解酶产生密切相关的子囊菌门和厚壁菌门。MC1处理中增强的木质素降解可能促进了后续纤维素和半纤维素的分解，从而提高了堆肥过程中木聚糖整体转化的效率。包括温度、碳氮比(C/N)、pH和电导率(EC)在内的理化指标表明，MC1改良的堆肥比BS1和对照处理更早达到腐熟状态，表明堆肥过程被加速。总之，这些发现凸显了具有强木质素分解潜力的微生物菌群对于克服堆肥系统中木聚糖材料顽固性的重要性。研究结果为开发有效的微生物菌剂以提高农业废弃物堆肥的效率和可持续性提供了理论基础和实践指导。
