基于逆转录重组酶辅助扩增与CRISPR/Cas12a的百香果病毒田间原位可视化检测

《Plants》：In Situ Visual Detection of TelMV, EAPV, and PaMoV in Passionfruit Using Reverse Transcription-Recombinase-Aided Amplification and CRISPR/Cas12a Cuiping Mo, Youcong Li, Jinqing Chen, Lihui Liu, Lixian Cui, Bixia Qin, Jianhe Cai, Huiting Xie and Zhanbiao Li

这篇研究通讯报道了一种利用逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）与CRISPR/Cas12a技术相结合建立的百香果病毒田间快速可视化检测平台。该方法针对百香果生产中的三种主要病毒病原体——西番莲斑驳病毒（TelMV）、东亚西番莲病毒（EAPV）和西番莲花叶病毒（PaMoV），实现了快速、高灵敏的现场诊断，整个流程可在30分钟内完成，无需复杂仪器，检测灵敏度相比常规RT-PCR方法提高了102-104倍，并与实验室RT-PCR结果高度一致，为田间病害的早期预警和绿色防控提供了有力的技术工具。

摘要

西番莲，又称百香果，是一种具有重要经济价值的热带水果，在我国热带和亚热带地区广泛种植。然而，病毒病的普遍发生严重阻碍了其安全生产。快速、灵敏、可现场判读的植物病毒检测方法对于有效预防和管理病毒病至关重要。本研究中，我们开发了一种利用逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）结合CRISPR/Cas12a技术的可视化检测系统（在蓝光或紫外光下观察），用于检测危害百香果生产的三种病毒：西番莲斑驳病毒（TelMV）、东亚西番莲病毒（EAPV）和西番莲花叶病毒（PaMoV）。在该系统中，三种病毒的RT-RAA反应最佳引物浓度均确定为0.4 μM，最佳反应温度为37 °C。最佳反应时间分别为TelMV 20分钟、EAPV 15分钟、PaMoV 30分钟。整个检测过程可在30分钟内完成，无需精密设备。对于TelMV和EAPV，该检测系统能够检测稀释度为10⁶的样品，与常规RT-PCR相比，灵敏度提高了约10⁴倍；对于PaMoV，该系统可检测稀释度为10⁶的样品，灵敏度比传统RT-PCR提高了约10²倍。这些结果证实了基于CRISPR/Cas12a的检测系统的成功开发。随后，该系统被应用于三种目标病毒的田间原位检测，其结果与实验室RT-PCR检测结果完全一致，这一致性凸显了该系统在田间检测重要作物病毒方面具有强大应用潜力。

引言

百香果是一种具有重要经济价值的热带水果，在我国广西、广东、福建、海南、云南和台湾等热带和亚热带地区广泛种植。近年来，因其独特风味和高市场价值，百香果产业持续扩张，但病毒病的普遍发生严重阻碍了其安全生产。目前已报道有超过44种病毒可侵染百香果，其中由马铃薯Y病毒属病毒，如西番莲斑驳病毒（TelMV）、东亚西番莲病毒（EAPV）和西番莲花叶病毒（PaMoV）构成的威胁最为显著。建立快速的田间原位检测方法，对于有效的病毒病管理具有迫切需求。

现有的植物病毒检测技术包括生物学、血清学和分子生物学方法。其中，聚合酶链式反应（PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等分子方法应用广泛，但通常需要设备完善的实验室和相对昂贵的试剂，限制了其在资源有限地区的应用。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR-Cas）系统是具有序列特异性的RNA引导的核酸内切酶复合物。其中，Cas12和Cas13等系统在识别靶标后具有附带切割活性，可导致单链DNA（ssDNA）或RNA报告基因的非特异性降解。这一特性已被用于创建高灵敏的核酸检测平台，如SHERLOCK、HOLMES和DETECTR，它们具有高灵敏度和直观的可视化读结果。等温扩增技术，如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶辅助/聚合酶扩增（RAA/RPA），能够在恒定温度下进行核酸扩增，使其适用于资源有限环境下的现场诊断。与逆转录酶结合后，LAMP和RAA分别转化为RT-LAMP和RT-RAA，可用于RNA病毒的检测。

TelMV、EAPV和PaMoV是中国南方百香果生产中三种重要的病毒病原体。为了给百香果病毒病的田间诊断和预测提供更便捷的技术工具，本研究开发了一种利用RT-RAA和CRISPR/Cas12a系统的快速、灵敏、特异且可视化的检测方法，以分别鉴定TelMV、EAPV和PaMoV。

结果

RT-RAA反应条件的优化

本研究利用从感染TelMV、EAPV和PaMoV的百香果叶片样品中提取的总RNA，优化了RT-RAA反应条件。针对每种病毒设计了多对引物，最终筛选出活性最高的引物组合用于后续实验：RAA-TelMV-3F/R (269 bp)、RAA-EAPV-1F/R (260 bp) 和 RAA-PaMoV-1F/R (250 bp)。随后评估了不同引物浓度、反应温度和反应时间对RT-RAA效率的影响。结果表明，当引物浓度在0.2至0.8 μM范围内时，三种病毒均获得最佳扩增效果，因此选择0.4 μM作为所有三种病毒的最佳引物浓度。在32–39 °C的反应温度范围内均可获得满意的扩增结果，最终确定37 °C为最佳RT-RAA反应温度。综合考虑后，将TelMV的RT-RAA反应时间设定为20分钟，EAPV为15分钟，PaMoV为30分钟。

CRISPR/Cas12a快速检测系统活性的验证

为验证CRISPR/Cas12a快速检测系统的可行性，我们确认了每个反应组分的必要性及LbCas12a蛋白的活性。分别构建了pEASY^?-Blunt Zero-TelMV、pEASY^?-Blunt Zero-EAPV和pEASY^?-Blunt Zero-PaMoV阳性标准质粒作为检测底物。扩增后，将RT-RAA产物进行CRISPR/Cas12a检测。当RT-RAA扩增产物被其特异性crRNA识别并与LbCas12a形成复合物时，激活的LbCas12a会切割淬灭的绿色荧光ssDNA报告分子，产生强烈的绿色荧光信号。为评估各组分的功能，分别进行了缺失单个组分的检测反应。结果表明，以pEASY^?-Blunt Zero-TelMV为底物时，反应管中的荧光信号强度迅速增加，在10分钟内几乎达到最大强度。对于pEASY^?-Blunt Zero-EAPV，荧光信号在30分钟后仍持续上升但速率显著放缓，而对于pEASY^?-Blunt Zero-PaMoV，荧光信号在20分钟后基本趋于稳定。相比之下，缺少LbCas12a、crRNA、ssDNA、RT-RAA产物或10×增强缓冲液的任何一组反应均未观察到荧光信号；只有包含所有组分的反应管才显示出强绿色荧光。这些结果表明CRISPR/Cas12a检测系统是可行的，且反应体系中的每个组分都是不可或缺的。

RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性分析

TelMV、EAPV和PaMoV均属于马铃薯Y病毒属，其基因组序列具有高度相似性。为验证引物RAA-TelMV-3F/R、RAA-EAPV-1F/R和RAA-PaMoV-1F/R的特异性，分别以阳性标准质粒为模板进行了RT-RAA反应。结果表明，电泳条带仅在相应的目标病毒中检测到，并且观察到特异性的荧光信号。这些数据表明，设计的引物具有良好的特异性，所建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法显示出优异的检测特异性。

RT-RAA-CRISPR/Cas12a和RT-PCR的灵敏度分析

将从感染TelMV、EAPV和PaMoV的百香果叶片中提取的总RNA作为模板，通过常规RT-PCR和RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法进行系列稀释检测，以比较其灵敏度。结果显示，RT-PCR可检测到10⁴倍稀释的TelMV (4.83 × 10^?3ng/μL)，而RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法在10⁷倍稀释 (4.83 × 10^?6ng/μL) 时仍然有效，灵敏度比常规RT-PCR提高了10⁴倍。对于EAPV，RT-PCR检测有效至10⁴倍稀释 (7.05 × 10^?3ng/μL)，而RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法在10⁷倍稀释 (7.05 × 10^?6ng/μL) 时仍产生清晰的绿色荧光信号，灵敏度提高了10⁴倍。对于PaMoV，RT-PCR检测有效至10⁵倍稀释 (6.93 × 10^?4ng/μL)，而RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法在10⁷倍稀释 (6.93 × 10^?6ng/μL) 时仍然可靠，灵敏度比常规RT-PCR提高了10²倍。

RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测系统在田间样品中的应用

为验证RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测系统对TelMV、EAPV和PaMoV的可行性，从广西主要百香果产区收集了疑似感染病毒的百香果样品。将样品制成粗提液用于RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测，并以RT-PCR结果作为对照。两种检测结果进行比较。对从广西百香果主产区采集的199份病害样品进行的统计分析表明，该地区三种病毒病的发生相对较为严重，使用RT-RAA-CRISPR/Cas12a方法的检出率高于RT-PCR。这表明本研究建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法可用于田间快速检测。

讨论

近年来，百香果产业持续增长，成为推动农村农业发展的重要动力。然而，病毒病的普遍发生严重阻碍了安全生产。早期、快速的病原体检测方法对于预防和控制这些病毒的传播至关重要。目前，用于检测百香果中TelMV、EAPV和PaMoV的诊断技术主要涉及RT-PCR、RT-qPCR和RT-LAMP，这些方法均需实验室条件和专门的检测设备，且耗时较长。因此，开发一种快速、灵敏、可视化的检测方法势在必行。目前尚无针对百香果病毒病的快速可视化检测方法的报道。

针对这一空白，本研究开发了一种利用RT-RAA-CRISPR/LbCas12a系统的RNA病毒可视化检测方法。该方法便携且成本效益高，无需复杂仪器，结果可直接在蓝光下肉眼观察，因此在田间原位检测方面具有巨大潜力。与其他植物病毒检测方法相比，该技术在三方面具有显著优势：首先，检测灵敏度更高。评估显示，与直接RT-PCR方法相比，RT-RAA-CRISPR/LbCas12a系统检测TelMV、EAPV和PaMoV的灵敏度分别提高了10²、10⁴和10²倍。其次，时间效率更高。传统RT-PCR通常需要至少一小时或更长时间，而基于荧光的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测可在10~30分钟内得出结果，使得田间原位病毒诊断可在约30分钟内通过简单的样品采集和试剂添加实现。第三，设备要求极低。该系统仅需一个恒温水浴锅或一杯温水，以及一个紫外手电筒。与需要反复热循环的传统PCR不同，RAA反应无需热循环，检测结果由CRISPR/LbCas12a系统在反应管内通过荧光直接显示。

目前，等温扩增结合CRISPR/Cas12a核酸识别系统已广泛应用于多种病毒的检测。值得注意的是，实验室病毒检测过程中的气溶胶污染风险不容忽视。为降低扩增产物转移导致气溶胶污染造成假阳性的风险，已开发出将核酸扩增和CRISPR检测整合在单个反应管中的方法。然而，由于等温扩增试剂与CRISPR/Cas12a检测系统之间的交叉干扰，这些方法的灵敏度通常会受到影响。本研究开发的检测平台专为田间病毒检测量身定制，与实验室环境相比，田间气溶胶污染较少，因此采用两步法以获得最佳的检测灵敏度。总之，本研究成功开发了一种针对TelMV、EAPV和PaMoV的快速、灵敏的可视化检测方法，在检测百香果植株中的这些病毒时表现出高效率，检测限明显低于RT-PCR。该系统已成功应用于田间检测，检出率与实验室RT-PCR相当甚至更高。

结论

在本研究中，我们开发了一种利用RT-RAA结合CRISPR/Cas12a的可视化检测系统，用于检测危害百香果生产的三种病毒：TelMV、EAPV和PaMoV。随后，该系统被应用于三种目标病毒的田间原位检测，其结果与实验室RT-PCR检测结果完全一致。目前，该检测方法正在被开发成用于百香果田间检测的便携式检测试剂盒，我们正在寻求合作企业进行商业化生产。该方法为百香果病毒病的田间诊断和预测提供了更便捷的技术工具，对我国的病毒病防控具有重要意义。