《Journal of Fungi》：Chromatic Variants of Pityriasis Versicolor and Molecular Species Identification Using Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
Marina Romero-Navarrete,
Francisca Hernández-Hernández,
Roberto Arenas,
Aureliano Castillo-Solana,
Lizbeth Magnolia Martínez-Aguilar,
Erika Córdova-Martínez,
Brianda Stephanie Herrera-Ramírez,
Settanan Plangsiri and
Teerapong Rattananukrom
编辑推荐：
本文是一项在墨西哥阿卡普尔科开展的花斑糠疹（PV）临床与病原学研究，揭示了该地区PV的临床特征和致病马拉色菌菌种分布，并评估了聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）在菌种鉴定中的应用价值，为该地区皮肤真菌病的流行病学和诊断提供了新见解。
引言
花斑糠疹（PV）是一种由亲脂性马拉色菌属酵母引起的常见浅表角质层真菌病。其临床表现为色素减退、色素沉着、红斑性或混合性斑疹，伴有细碎鳞屑，好发于皮脂溢出区域，如躯干、颈部和上肢。在儿童中，面部受累更为常见。尽管是良性病变，PV具有慢性和高复发性的特点，据报道一年内复发率可达60%，两年内可达80%。PV是热带和亚热带地区的流行性皮肤病，在温带气候中则较少见。其诱发因素包括高温、潮湿、皮脂分泌增加、多汗、油性皮肤、使用外用油剂或皮质类固醇以及免疫抑制。该病主要影响青少年和年轻人，可能反映了青春期后皮脂分泌的增加，且在一些研究中报告了轻微的男性患病优势。包括球形马拉色菌、糠秕马拉色菌和合轴马拉色菌在内的多种马拉色菌与PV相关，但其种属分布存在地域差异。在墨西哥，马拉色菌的鉴定传统上依赖于表型和生化方法，这些方法可能缺乏精确性和可重复性。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等分子方法为种水平鉴定提供了更准确可靠的手段。鉴于阿卡普尔科的热带气候以及该地区有限的分子流行病学数据，本研究旨在描述墨西哥人群中PV的临床和流行病学特征，并使用两种限制性内切酶的PCR-RFLP来鉴定相关的马拉色菌种。
材料与方法
本研究于2024年在阿卡普尔科总医院和一家私人皮肤科诊所进行了一项横断面研究，纳入了所有年龄和性别、临床诊断为PV并经马拉色菌分离培养确诊的患者。参与者需在过去三个月内未接受免疫抑制剂、皮质类固醇或局部/全身性抗真菌药物治疗。该研究获得了墨西哥格雷罗州卫生部门机构审查委员会的批准。通过刮取皮损处鳞屑获得样本，并使用20%氢氧化钾或亚甲蓝进行直接镜检，观察特征性的短而粗的菌丝和酵母细胞。样本在改良Dixon琼脂上培养，并于32°C下孵育长达三周。对疑似马拉色菌的菌落进行镜检，使用乳酸酚蓝确认酵母样形态，并进行革兰氏染色涂片以评估培养物纯度。共获得69例患者的马拉色菌分离株用于种属鉴定。所有分离株均进行了宏观和微观评估。在显微镜下，球形马拉色菌呈圆形至卵圆形酵母细胞簇，而糠秕马拉色菌显示为出芽酵母细胞，偶见短菌丝。代表性分离株在形态学上分别确认为球形马拉色菌和糠秕马拉色菌。此外，限制马拉色菌显示为小而圆至卵圆形的酵母细胞，偶见短的、无分枝的菌丝，通常单生或成对排列。斯洛夫马拉色菌显示为卵圆形至圆柱形酵母细胞，带有极性出芽；偶尔可观察到短的假菌丝。对显示两种或以上不同菌落形态的培养物进行亚培养并单独分析。对所有分离株进行过氧化氢酶测试；过氧化氢酶阴性结果高度提示为限制马拉色菌。此外，将培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂以检测厚皮马拉色菌，通过阳性生长确认。将纯分离株通过大量划线接种于改良Dixon琼脂，在32°C下培养5-7天，以获得足够的生物量用于DNA提取。所有分离株和参考菌株最初均使用常规表型方法进行鉴定，包括评估菌落形态、在Dixon琼脂上的脂质依赖性、过氧化氢酶反应以及酵母细胞形状和出芽模式的显微镜检查。这些初步的表型鉴定随后通过26S rDNA区域的PCR扩增和随后的RFLP分析得到证实。
DNA提取与PCR
酵母质量直接从琼脂上收集。随后使用苯酚-氯仿法或GeneAll Exgene? Plant SV Mini提取试剂盒进行DNA提取。提取的DNA经定量并在0.8%琼脂糖凝胶上分析，用GelRed染色。使用特异性引物，以50 ng DNA为模板，对高度保守的26S rDNA区域进行PCR扩增：正向引物 (Fw): 5′-TAA CAA GGA TTC CCC TAG TA-3′ 和反向引物 (Rev): 5′-ATT ACG CCA GCA TCC TAA G-3′。PCR反应在50 μL反应体积中进行，包含1× PCR缓冲液、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTPs、0.2 mM 引物和2.5 U重组Taq DNA聚合酶。PCR扩增条件包括：94°C初始变性5分钟；随后进行30个循环，每个循环包括94°C变性45秒、55°C退火45秒、72°C延伸1分钟；最后72°C终延伸7分钟。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上分离，产生600 bp的片段，随后使用DNA Clean & Concentrator-5?试剂盒纯化并定量。
限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析
使用两种限制性内切酶HhaI和BstCI对PCR产物进行消化。消化反应在10 μL最终体积中进行，包含1×缓冲液、200 ng PCR产物和10 U限制性内切酶。HhaI的孵育条件设置为37°C，BstCI设置为65°C，两种酶的优化孵育时间均为3小时。随后，消化产物在2.5%琼脂糖凝胶上于75 V电压下电泳1.5小时。将所得限制性图谱与先前在类似条件下进行的研究进行比较。所有分离株的PCR扩增均产生了与参考菌株相似的600 bp片段。随后通过RFLP分析，基于HhaI和BstCI酶的消化图谱，并与参考菌株进行比较，确认了物种鉴定。
统计分析
使用平均值或中位数总结连续变量，使用频率和百分比总结分类变量。使用卡方检验或Fisher精确检验（如适用）进行临床结果的比较。所有统计分析均使用STATA 18.0版进行。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
流行病学数据
共纳入69例临床诊断为PV的患者，年龄范围从2个月到72岁。大多数病例发生在11-20岁年龄组（34.8%），其次是21-30岁（18.9%）和0-10岁（17.4%）组。在41-50岁年龄组中，患病率显著下降，仅为7.2%，而50岁以上者则偶有病例。男性患者明显多于女性，占病例的68.1%，而女性占31.9%。
与马拉色菌菌种相关的花斑糠疹临床类型
色素减退型是最普遍的临床表现，见于44例患者（63.8%），其次是色素沉着型（15.9%）、红斑型（8.7%）、色素减退-红斑型（5.8%）和色素减退-色素沉着型（5.8%）。按菌种（基于列百分比）分析时，色素减退性皮损在糠秕马拉色菌（72.7%）和球形马拉色菌（69.6%）分离株中最常见。色素沉着性皮损最常与合轴马拉色菌（50.0%）相关，而在球形马拉色菌（17.4%）和糠秕马拉色菌（4.6%）中较少见。红斑性皮损在50.0%的斯洛夫马拉色菌分离株和16.7%的合轴马拉色菌分离株中发现。混合性皮损类型（色素减退-红斑型和色素减退-色素沉着型）在各菌种间分布，无明显的优势菌种。统计分析显示，临床形态与分离出的马拉色菌菌种之间无统计学显著关联，使用Fisher精确检验的P值均大于0.05。
与性别相关的花斑糠疹临床类型
共有47例（68.1%）男性和22例（31.9%）女性。色素减退型是两性中最常见的表现，见于32名男性（68.1%）和12名女性（54.6%）。色素沉着性皮损见于6名男性（12.8%）和5名女性（22.7%），而红斑型则在每组中各3名患者中发现（男性6.4%，女性13.6%）。色素减退-红斑性皮损仅在男性患者中观察到（8.5%），而色素减退-色素沉着性皮损则在两性中各2名患者中出现。统计分析显示，性别与PV的临床类型之间无统计学显著关联，使用Fisher精确检验的P值大于0.05。
马拉色菌菌种与性别的关联
总体而言，最常鉴定的菌种是球形马拉色菌（33.3%）和糠秕马拉色菌（31.9%）。在男性患者中，糠秕马拉色菌（36.2%）略多于球形马拉色菌（29.8%）。相比之下，在女性中，球形马拉色菌（40.9%）比糠秕马拉色菌（22.7%）更常见。由于限制性图谱与任何参考菌株或先前报道的物种不匹配，有11.6%的病例在种水平鉴定结果不明确，被归类为马拉色菌属。斯洛夫马拉色菌仅在女性患者中检出（9.1%），而男性患者中未分离出该菌。然而，统计分析显示性别与马拉色菌菌种的分布之间无显著关联。在三例婴儿病例（年龄小于1岁）中，在两名分别表现为色素减退和色素减退-红斑型皮损的患者（年龄2个月和8个月）中鉴定出糠秕马拉色菌，而在一名3个月大、表现为色素减退-红斑型皮损的患者中分离出限制马拉色菌。
讨论
自马拉色菌被确定为PV的病原体以来，其鉴定主要依赖于表型和生化方法。由于形态学和生化方法的局限性，随后开发了各种分子技术来改进物种鉴定。分子工具如PCR-RFLP、巢式PCR、多重PCR、实时PCR和测序已越来越多地被采用以进行准确的种水平鉴定。阿卡普尔科位于墨西哥南太平洋沿岸，属于湿热的热带气候，温度为21°C至34°C，为PV的发展创造了理想条件。本研究中，患病率最高的是11-20岁年龄组，这与埃及、阿根廷和伊朗的报告不同，后者的最受影响年龄组在20-30岁之间。同样，一项巴西临床流行病学研究报告称，PV在青春期前后更普遍，最受影响年龄组在10-19岁之间。另一项巴西门诊病例系列发现青少年和年轻成人（10-20岁）频率最高。重要的是，我们记录了三例1岁以下婴儿的病例，据我们所知，这是墨西哥首次报道在该年龄组中使用分子方法确认马拉色菌菌种鉴定。青春期后PV的增加主要归因于皮脂量和成分的变化，为马拉色菌生长创造了富含脂质的环境。然而，其他因素也可能促成，特别是在年轻个体中。使用皮肤油剂和润肤剂、高湿度以及频繁出汗可能增加皮肤脂质并促进马拉色菌增殖。皮肤微生物组和屏障成熟度的差异也可能影响易感性。因此，除了青春期的皮脂变化外，外源性脂质暴露和与年龄相关的皮肤生理学可能也发挥作用。PV是热带地区的流行性皮肤病，诊断主要基于临床表现。在本研究中，确定了五种临床变异。在三例1岁以下儿童中，两例表现为色素减退-红斑性皮损，一例表现为色素减退型。马拉色菌的传统鉴定方法依赖于形态学和生化标准。然而，最近的研究强调了分子技术具有更高的敏感性和特异性。例如，埃及的一项研究报告称，与表型方法75%的检出率相比，PCR的检出率为100%。一项涵盖18个国家22项研究的系统综述表明，PCR-RFLP常用于物种鉴定。阿根廷、智利、埃及、印度、伊朗和越南等国均已实施PCR-RFLP用于此目的。在21个公认的马拉色菌物种中，有10个已通过分子研究被证实与PV相关，包括球形马拉色菌、限制马拉色菌、合轴马拉色菌、皮肤马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌、斯洛夫马拉色菌、大和马拉色菌、厚皮马拉色菌和日本马拉色菌。在之前的研究中，鉴定出六种菌种：球形马拉色菌、糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌、限制马拉色菌、斯洛夫马拉色菌和皮肤马拉色菌。在本研究中，最常分离的菌种是球形马拉色菌，这与中国、希腊、伊朗、以色列和土耳其的研究结果一致。此外，来自中国、埃及、印度、伊拉克、日本和越南的研究确定糠秕马拉色菌为优势菌种，这与我们的发现一致，即糠秕马拉色菌是常见分离菌种。相比之下，在阿根廷，合轴马拉色菌是最常见的物种。马拉色菌菌种分布的地理差异可能反映了气候、宿主遗传、皮肤微生物群、生活方式和诊断方法学的不同，所有这些都可能影响各地区的物种流行率。在本研究中，球形马拉色菌和糠秕马拉色菌被确定为与PV相关的主要菌种，尤其是在色素减退性皮损中，色素减退性皮损是最常见的临床形式。在男性患者中观察到更高的频率，特别是那些患有色素减退性变异的患者。虽然糠秕马拉色菌、限制马拉色菌和合轴马拉色菌更常从男性中分离，但这些关联无统计学意义。数据表明PV可能存在菌种和性别相关的偏好趋势，但需要更大样本量的进一步研究来澄清这些观察结果。多项研究调查了PV的临床类型（包括色素沉着）是否与马拉色菌菌种相关，但结果仍不一致。许多研究报告菌种与皮损颜色之间没有明确关联，表明宿主因素和研究设计可能比菌种本身发挥更大作用。我们的PCR-RFLP方法使用HhaI和BstCI在鉴定所有分离株方面显示出局限性。一些限制性图谱与已知图谱不匹配，被归类为马拉色菌属。三个最初怀疑是那拿马拉色菌、皮肤马拉色菌和合轴马拉色菌的分离株，后来通过测序确认为糠秕马拉色菌，这可能反映了种内变异性。大量研究采用PCR-RFLP检测马拉色菌，通常靶向26S rDNA基因（与本研究一致）或ITS2区域及ITS3/ITS4引物。影响PCR-RFLP性能的一个关键因素是限制性内切酶的选择和数量。大多数研究使用一种或两种酶。例如，CfoI能够区分五种物种：球形马拉色菌、糠秕马拉色菌、限制马拉色菌、合轴马拉色菌和斯洛夫马拉色菌。HhaI单独可鉴定球形马拉色菌和限制马拉色菌。相比之下，结合ITS3/ITS4与HinfI和AluI可区分七种物种。使用26S rDNA与HhaI和BstCI结合实现了最高的区分能力，成功鉴定了11个物种：糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌、球形马拉色菌、限制马拉色菌、斯洛夫马拉色菌、钝形马拉色菌、皮肤马拉色菌、日本马拉色菌、大和马拉色菌、厚皮马拉色菌和那拿马拉色菌。这种方法也用于我们的研究，仍然是最强大的PCR-RFLP方法之一。总体而言，PCR-RFLP是一种经济高效、操作简单的技术，可用于区分多种马拉色菌。不依赖培养的方法包括常规PCR、多重PCR、实时PCR和PCR测序。常规PCR最经济，但分辨率最低。例如，ITS3/ITS4引物仅检测到糠秕马拉色菌、厚皮马拉色菌和球形马拉色菌。其他使用多对引物的研究最多鉴定出四种物种，而靶向ITS2的方法未能区分限制马拉色菌、斯洛夫马拉色菌和厚皮马拉色菌。此外，这些方法通常需要多个反应，与PCR-RFLP相比增加了时间和成本。多重PCR允许使用产生不同大小扩增产物的物种特异性引物来检测多种物种。一项研究使用三对引物组，通过三个反应区分了11个物种。虽然有效，但由于需要多个平行反应，该方法劳动强度大。其主要优势在于比PCR-RFLP更有效地检测混合感染。PCR测序提供了最高的准确性，并可通过与参考数据库比较序列来区分同一物种内的菌株。然而，高昂的成本和对专业设备的需求限制了其在PV诊断中的常规使用。
结论
使用PCR-RFLP鉴定了与PV相关的马拉色菌属，检测到五个主要物种：球形马拉色菌、糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌、限制马拉色菌和斯洛夫马拉色菌。球形马拉色菌和糠秕马拉色菌是这个热带墨西哥队列中PV的主要致病菌，尤其是在色素减退性皮损中。PCR-RFLP被证明是种水平鉴定的可靠工具，凸显了临床感染中马拉色菌属的多样性。目前，尚无标准化的分子方法用于马拉色菌物种的鉴定。需要进一步的研究来提高我们对马拉色菌感染的区域和国家流行病学及其在PV中的临床表现的理解。
