《Journal of Fungi》：Biphasic Regulation of Epithelial Antimicrobial Peptides During Candida albicans Vaginal Infection: Distinct Contributions of NLRP3/IL-1β and IL-17RA Pathways to β-Defensin-1 and -3 Expression
Sofía Carla Angiolini,
Emilse Rodriguez,
Clarisa Manzone-Rodriguez,
Paula Alejandra Icely,
María Soledad Miró,
Fernando Oscar Riera,
Pablo Iribarren,
Juan Pablo Caeiro and
Claudia Elena Sotomayor
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本项研究揭示了宿主免疫信号通路在白念珠菌阴道感染过程中精细调控上皮防御素表达的关键作用。研究发现在野生型小鼠中，阴道黏膜屏障的关键组分BD-1和BD-3的表达呈现“早期诱导、后期衰减”的双相模式。通过基因功能缺失方法，该研究首次在体内证实NLRP3/IL-1β信号通路是感染早期BD-1上调所必需的，而IL-17RA信号通路则对BD-3的持续表达起支持作用。这项工作阐明了不同免疫通路在时间上对防御素的特异性调控，为理解VVC/RVVC的免疫病理机制提供了新见解。
引言
白念珠菌是一种常见于人类黏膜菌群的共生真菌，同时也是外阴阴道念珠菌病的主要病原体。VVC是一种急性炎症性疾病，约75%的女性在其育龄期至少会经历一次，其复发形式RVVC影响着全球大量女性，构成显著的公共卫生负担。阴道黏膜的抗真菌免疫反应具有其独特性，涉及包括上皮细胞、模式识别受体在内的严密监控机制。当白念珠菌从酵母态向菌丝态转换时，标志着其向致病性的转变，会触发组织入侵、上皮活化、抗菌肽表达、强烈的IL-1β驱动的炎症反应以及中性粒细胞的募集。在黏膜部位抗真菌防御中，IL-1β和IL-17是协调局部免疫反应的关键细胞因子，而上皮细胞产生的β-防御素则是黏膜屏障中具有广谱抗微生物活性的重要效应分子。其中，人β-防御素1在未发炎的黏膜中组成性表达，而hBD3等诱导型防御素则可在感染或炎症刺激下迅速上调。本研究旨在利用NLRP3和IL-17RA信号通路缺陷的小鼠模型，阐明这些关键通路在阴道黏膜中调控上皮BD-1和BD-3表达的具体贡献。
方法
本研究使用高毒力白念珠菌SC5314菌株建立小鼠VVC模型。实验动物包括C57BL/6J野生型小鼠、Nlrp3-/-小鼠和Il17ra-/-小鼠。通过皮下注射β-雌二醇17-戊酸酯使小鼠处于假动情期，并于第0天经阴道接种5×106个活酵母细胞或PBS。分别于感染后第2、4、8天收集宫颈阴道灌洗液，用于后续分析。通过菌落形成单位计数评估真菌负荷，通过细胞离心涂片和May–Grünwald Giemsa染色进行多形核中性粒细胞计数，采用ELISA法检测CVL中IL-1β和IL-17A的浓度。通过免疫荧光法，使用兔抗小鼠BD-1或BD-3一抗和Alexa Fluor 488标记的二抗，在Leica DMi8倒置荧光显微镜下观察并检测CVL回收的上皮细胞中mBD1和mBD3的蛋白表达。通过ImageJ软件对荧光强度进行半定量分析，数据以均数±标准误表示，采用t检验、Mann-Whitney检验或方差分析等进行统计学分析。
结果
1. 野生型小鼠实验性VVC的感染建立与局部炎症特征
在感染白念珠菌SC5314的野生型小鼠中，阴道真菌负荷在感染后第2、4天维持高位，第8天显著下降。同时，观察到PMN在感染后第2天募集达到高峰，随后在第4、8天显著减少。CVL中IL-1β的水平在感染后第2、4天最高，第8天显著下降。而IL-17A在感染和未感染小鼠的CVL中均维持在较低水平。
2. 白念珠菌SC5314感染差异调控阴道黏膜mBD1和mBD3的表达
mBD1和mBD3在感染过程中均表现出双相表达模式。mBD1在感染后第2天显著上调，与未感染组相比增加了约380%，但在第4、8天，其表达水平被显著抑制，分别比未感染组降低了37%和75%。类似地，mBD3在感染后第2天显著上调，与未感染组相比增加了159%，但在第4、8天，其表达也分别比未感染组降低了68%和75%。雌激素处理在未感染小鼠中可刺激两种防御素的表达。
3. NLRP3炎症小体通路驱动白念珠菌阴道感染早期的mBD1而非mBD3诱导
Nlrp3-/-小鼠表现出与野生型小鼠相当的阴道真菌定植水平。在感染后第2天，野生型小鼠感染后mBD1表达显著高于未感染组，而Nlrp3-/-小鼠的感染组与未感染组之间mBD1表达无显著差异。与感染野生型小鼠相比，感染Nlrp3-/-小鼠的mBD1表达显著降低。相反，mBD3在野生型和Nlrp3-/-感染小鼠中均能被成功诱导，且两组间表达水平无显著差异。这表明NLRP3/IL-1β信号通路是感染早期mBD1诱导所必需的，而对mBD3的调控不依赖此通路。
4. IL-17RA信号通路差异调控白念珠菌阴道感染中的mBD1和mBD3表达
Il17ra-/-小鼠的阴道真菌负荷动态与野生型小鼠类似。在感染后第2天，尽管Il17ra-/-小鼠感染后mBD1表达也高于其未感染组，但其水平显著低于感染的野生型小鼠。对于mBD3，野生型感染小鼠表达上调，而Il17ra-/-小鼠在感染后未能上调mBD3表达，其水平显著低于感染的野生型小鼠。这表明IL-17RA信号通路对mBD3的诱导起主导作用，而对mBD1的表达仅有部分贡献。
讨论
本研究揭示了在白念珠菌阴道感染中，上皮防御素的表达受到精细的时空调控。感染早期，黏膜迅速上调BD-1和BD-3作为抗菌屏障反应。但随着感染进展，真菌通过其毒力因子（如天冬氨酸蛋白酶和脂肪酶）主动抑制防御素的表达，这是一种关键的免疫逃逸策略，可能促进感染的持续和复发。研究通过遗传学方法明确了调控此过程的关键宿主信号通路：NLRP3/IL-1β信号通路是驱动早期BD-1上调的核心，而IL-17RA信号通路则对BD-3的诱导和维持至关重要。这一发现将特定的宿主免疫感应机制与上皮抗菌效应器的产生直接联系起来。
值得注意的是，尽管NLRP3/IL-1β和IL-17信号在控制阴道真菌负荷方面被证明是非必需的，但它们却在塑造上皮AMP反应中扮演了关键角色。这表明在阴道黏膜这一特殊环境中，炎症反应与病原体清除之间存在脱节，而上皮内在的防御程序独立于经典的免疫细胞清除功能。该研究构建了一个双相调控模型，为理解VVC/RVVC的免疫病理机制提供了新框架，即早期有效的防御素反应可能抑制感染，而后期真菌介导的防御素抑制则可能导致防御崩溃和症状发展。这些发现不仅增进了对黏膜固有免疫的理解，也为开发针对特定免疫通路或直接补充防御素的治疗策略以治疗VVC，特别是RVVC，提供了潜在的新靶点。
