《Agriculture》：Upcycling Residues from Salvia rosmarinus Distillation and Agroforestry Processes into a Dual-Function Bioagrochemical with Biostimulant and Antifungal Properties
Gonzalo Ortiz de Elguea-Culebras,
Tamara Ferrando-Beneyto,
Enrique Melero-Bravo and
Raúl Sánchez-Vioque
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本文探讨了将芳香植物（迷迭香）精油蒸馏残渣与农林业加工副产物相结合，开发新型多功能生物农业化学品的创新策略。该研究通过系统筛选溶剂与助剂，成功配制出兼具优良水分散性、促生与抗真菌活性的复合制剂，在促进莴苣(Lactuca sativa)生长的同时抑制黑曲霉(Aspergillus flavus)，体现了剂量依赖的“双重功能”（生物刺激/抗真菌或除草/抗真菌）。工作紧扣循环生物经济框架，为减少传统农用化学品、实现农业可持续发展提供了有前景的解决方案。
1. 引言
当前作物保护、公共卫生和环境可持续性面临的挑战，以及病虫害抗药性的增加，推动了对新型生态活性物质的探索。全球农业的一个主要目标是提高作物生产力，同时减少土地、农用化学品或水的消耗。这一目标可以通过生物工程方法或开发生物刺激剂来实现。这些创新产品包括微生物接种剂，它们能增加养分固定、提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性，并通过添加有机化合物（如腐殖酸或富里酸、蛋白质和氨基酸、多糖以及多种植物源性代谢物，包括酚类化合物）来促进生长。在此背景下，将农林业和城市残留物作为具有植物刺激潜力的生物活性化合物的可持续来源进行价值提升，越来越受到关注，这与循环生物经济的原则相一致。特别是芳香植物精油(EO)蒸馏后的残留生物质，已显示出对碱性土壤的生物肥料功能，以及对模型种子如莴苣(Lactuca sativa)、黑麦草(Lolium perenne)和番茄(Solanum lycopersicum)生根的生长促进作用。
为了确保这些材料作为载体的安全有效使用，有必要根据多种农业应用标准对它们进行评估。有效的配方还需要能够增强分散性、渗透性和润湿性的助剂（或添加剂），以及能够延长稳定性和功效的防腐剂，并考虑成分相容性。此外，还有其他技术和经济考虑因素，包括成本效益和大规模适用性，以确保实际和可持续的实施。
2. 材料与方法
2.1. 源自残留农林业的原料
研究选用了乙醇、甘油、聚山梨酯-20 (Tween-20)和L-抗坏血酸等作为原料。所有试剂均为分析级、食品级或医药级。一般而言，选择溶剂和共溶剂乙醇、甘油、丙二醇(PG)和二甲亚砜(DMSO)来开发溶剂系统(S)，而将助剂大豆卵磷脂和聚山梨酯-20作为分散剂/乳化剂加入，醋酸和抗坏血酸作为防腐剂用于形成水基质(A)。
2.2. 迷迭香(S. rosmarinus)固体蒸馏副产物的乙醇提取(SrEE)
先前的研究中，对来自不同驯化种群的迷迭香(Salvia rosmarinus)蒸馏生物质的乙醇提取物进行了表征。结果，选择了一个原产于西班牙萨拉戈萨Pina de Ebro的种群，因其表现出强大的生物刺激作用、抗真菌活性和高含量的鼠尾草酸。植物材料经过水蒸馏，随后使用96%乙醇作为提取溶剂，通过索氏提取16小时进行提取物制备。提取后，将乙醇溶液过滤以去除残留杂质，并在50°C和175 mbar条件下使用旋转蒸发仪浓缩。将获得的粗提取物在45°C的烘箱中干燥48小时以确保完全去除溶剂，随后精细研磨以获得均匀粉末。最终对所得迷迭香乙醇提取物(SrEE)的生物能力及其酚类成分进行了评估。
2.3. 所选原料对测试模型种子的评估
所有原料均评估了其化感作用，以确定具有促生长潜力或较低植物毒性作用的成分。实验使用莴苣(Lactuca sativa)和黑麦草(Lolium perenne)的模型测试种子进行。评估了不同浓度下溶剂、共溶剂和助剂对种子发芽和幼苗早期生长的影响。将种子置于含滤纸的12孔板中，添加不同浓度的测试液，在生长室中培养，定期记录发芽情况，并使用ImageJ软件测量随机选择的幼苗的根和/或芽长度。
2.4. 产品配方
选择那些具有促生长潜力或植物毒性作用较低的成分（溶剂和助剂）作为迷迭香(S. rosmarinus)乙醇提取物(SrEE)的潜在载体。首先将SrEE以10% (w/w)的浓度溶解在三种选定的溶剂系统(S)中，加热并均质。随后，将浆料以1:4的比例与含有剩余助剂（包括表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂）的三种不同水基质(A)混合。然后重新加热并均质。因此，按照32因子设计，制备了九种最终SrEE浓度为2.5% w/w的配方。类似地，通过用等量的水替换植物提取物，也获得了九种载体。此外，作为阳性对照，将SrEE直接溶解在96%乙醇中，浓度为25 mg/mL，该溶剂也作为载体。最终，将二十个样品在4°C下储存以待表征。
2.5. 测试配方的pH值和水分散能力
使用pH计测量配方的pH值。为了评估每种处理在水中的分散性，在96孔板中以三重复形式加入浓度范围从1.25到10 μL/mL的分析配方。在酶标仪中测定配方的最大吸光波长，并在670 nm处固定。在25°C下，以10分钟为间隔，在10小时内监测光密度(OD)，以监测与SrEE提取物沉淀相关的吸光度降低。从OD与时间的线性回归中确定5小时时的OD值(OD5h)，并计算溶解度(%)为(OD5h/OD0h) × 100。最后，对估计的5小时溶解度与测试浓度进行线性回归模型拟合，仅对模型拟合度强(R2> 90%)的配方，估算保持溶解度高于90%的最高浓度(S90)。
2.6. 产品的生物刺激剂评估
对样品进行化感生物测定，以识别那些表现出更大生物刺激活性并拒绝最具植物毒性的样品，使用模型种子物种莴苣和黑麦草。实验条件与之前描述的基本相同。在测定前，将所有配方及其相应的载体在蒸馏水中以12.50至100 μL/mL (w/v)的浓度溶解，并将700 μL每种溶液仔细分配到孔中。每种处理进行四重复以考虑实验变异性，并重复两次。随后，在受控的温度和光照条件下培养平板。在整个实验期间（莴苣7天，黑麦草10天）类似地监测种子发芽和早期幼苗生长，从而定量比较不同配方的生物刺激效果。
计算发芽指数(GI)作为一个综合参数，结合最终发芽率（相对发芽率，RG）和幼苗生长。对于莴苣，幼苗生长表示为相对根生长(RRG)，而对于黑麦草，则考虑相对根生长(RRG)和相对芽生长(RSG)。GI值 > 100%表示积极的生长响应，且生物刺激能力随值增加而增强，而值在100%到0%之间则反映逐渐增加的植物毒性作用。
3. 结果与讨论
3.1. 原料的植物毒性评估与筛选
对预选成分（溶剂和助剂）进行了植物毒性测试。结果表明，大多数成分在测试浓度范围内对两种模型种子的发芽和生长影响相对较小。其中，DMSO、聚山梨酯-20和大豆卵磷脂在较低浓度下表现出较好的安全性。基于最低不利影响的原则，筛选出后续配方开发的候选成分。
3.2. 配方开发与水分散性
基于32因子设计，制备了九种含有SrEE的配方。大多数配方在水中表现出良好的分散性。通过监测光密度随时间的变化评估了配方的物理稳定性。线性回归模型分析表明，许多配方在5小时内能保持较高的溶解度。在评估的载体中，不含甘油且含有高比例聚山梨酯-20和大豆卵磷脂的载体，在物理稳定性、分散性和生物活性方面表现出最均衡的综合性能。
3.3. 生物刺激与抗真菌双重活性
3.3.1. 对模型种子的生物刺激/抑制作用
对配方的生物刺激评估显示，大多数配方能显著提高莴苣的发芽指数(GI)，表现出生物刺激活性。与此同时，许多配方能减少黑麦草的发芽指数，显示出抑制（或潜在除草）效应。这些刺激和抑制效应都表现出明显的剂量-反应关系，通过四参数对数逻辑(log10(x))模型得以证实。结果表明，刺激和抑制效应都强烈受浓度影响，突出了优化施用剂量的重要性。
3.3.2. 抗真菌活性
研究还评估了配方对真菌黑曲霉(Aspergillus flavus)生长的抑制能力。结果显示，基于SrEE的配方能够显著抑制该真菌的生长，且抑制效果也呈剂量依赖性。这证明了所开发配方具有抗真菌潜力。
3.4. 最佳配方与机制探讨
在评估的载体中，缺乏甘油但含有高比例聚山梨酯-20和大豆卵磷脂的载体，在物理稳定性、分散性和生物活性方面表现出最均衡的综合性能。这种响应可归因于提取物和所选载体成分的共同贡献。载体成分（如乳化剂）不仅改善了提取物在水中的分散和稳定性，可能还通过影响细胞膜渗透性等方式，协同增强了提取物本身的生物活性（包括促生和抗真菌成分，如鼠尾草酸等酚类物质）的效果。
4. 结论
这项研究成功地利用迷迭香蒸馏残渣的乙醇提取物，结合筛选自农林业副产物的安全溶剂和助剂，开发出了一种新型的多功能生物农业化学品。所制备的配方不仅具有良好的水分散性，更重要的是，展现出剂量依赖的“双重功能”：一方面能作为生物刺激剂促进某些作物（如莴苣）的生长；另一方面，又能抑制杂草模型（黑麦草）的生长和真菌（黑曲霉）的繁殖，具备了潜在的抗真菌或除草/抗真菌联合应用前景。这项工作充分证明，源自农林业副产品的生物农业化学品，可以在循环生物经济的框架下，提供创新的、环境友好的植物保护与生长促进解决方案，有助于减少对传统高环境负荷农用化学品的依赖，推动农业的可持续发展。
