《Pathogens》：Molecular Detection and Identification of Bacterial Pathogens in Qinghai Province, China
Didi Zhang,
Yihong Ma,
Xinyuan Zhao,
Huaixing Yang,
Xiuping Li,
Guanghua Wang,
Yong Hu,
Shenghua Tang,
Rong Li and
Liqing Ma
+ 2 authors
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本综述通过对青海高原牧区优势蜱种（Dermacentor nuttalli 与 Haemaphysalis qinghaiensis 为主）进行六种细菌性病原体（Brucella spp.、Rickettsia spp.、Anaplasma phagocytophilum、Borrelia burgdorferi sensu lato、Francisella tularensis、Coxiella burnetii）的分子检测，首次系统揭示了该地区蜱媒病原的流行本底。研究发现 Rickettsia spp.（以 R. raoultii 为主）在蜱中携带率较高（16.29%），而 Brucella spp. DNA 仅在 H. qinghaiensis 中检出（2.53%）。研究填补了高原蜱媒病原数据的空白，为当地蜱媒人兽共患病（tick-borne zoonotic diseases）的风险评估与防控提供了关键分子流行病学依据。
1. 引言
蜱是专性吸血节肢动物，是多种病原体在人类、牲畜和野生动物间传播的主要潜在媒介。蜱传细菌病在全球范围内威胁公共卫生和畜牧业生产，引起广泛关注。中国记录有125种蜱（111种硬蜱，14种软蜱），约占全球多样性的13%，其分布受环境和气候因素影响。青海省位于青藏高原东北部，平均海拔超过3000米，是独特的高海拔牧区生态系统，也是新发/再发人兽共患病的重点区域。其寒冷、低氧的环境以及广泛的人-动物界面（以牦牛和藏羊为主要牲畜）为蜱及蜱传病原体提供了有利的生态位。该地区已记录32种蜱，其中青海血蜱（Haemaphysalis qinghaiensis）、草原革蜱（Dermacentor nuttalli）和森林革蜱（Dermacentor silvarum）为优势种。这些蜱携带多种病原体，对当地畜牧业和公共卫生构成风险——鉴于该地区疾病监测能力有限，这一问题尤为关键。值得注意的是，布鲁氏菌病在青海省流行，且近年呈上升趋势，给畜牧业造成严重经济损失并带来公共卫生风险。虽然在其他地区蜱体内检测到过布鲁氏菌（Brucella spp.）DNA，但蜱介导的布鲁氏菌传播尚未得到证实，且缺乏青海蜱中布鲁氏菌的数据。此外，青藏高原独特的生态和气候条件（如低温、有限的人类活动）可能改变蜱-病原体相互作用，使得在此有针对性地调查蜱传病原体具有生物学和流行病学意义。五种全球重要的蜱传人兽共患病原体——嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）、立克次体属（Rickettsia spp.）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu lato）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）和伯内特考克斯体（Coxiella burnetii）——已在全球范围内与人类和牲畜疾病相关联。虽然嗜吞噬细胞无形体、立克次体属、伯氏疏螺旋体 sensu lato 和伯内特考克斯体已在青海蜱中检出，其中嗜吞噬细胞无形体在当地蜱种中显示出3.1%的DNA检出率，但数据仍然零散。高致病性人兽共患病原体土拉弗朗西斯菌在青海蜱中尚无报道。因此，本研究旨在系统调查这六种病原体在青海代表性蜱种中的DNA检出率与分布，以阐明其在这一高海拔生态系统中的流行病学状况，为风险评估提供流行病学数据。
2. 材料与方法
2.1. 蜱样本采集与形态学鉴定
蜱采样在2024年和2025年蜱活动高峰期（4月至5月）进行。采样点覆盖青海省多个行政区域，包括西宁市的大通县和湟源县；海东市的乐都区、民和县、互助县、循化县和化隆县；海北藏族自治州的门源县和刚察县；以及黄南藏族自治州的尖扎县。根据当地不同景观，采用旗诱法收集游离蜱，共采集1025只游离蜱样本。所有蜱样本单独保存于装有75%乙醇的无菌离心管中，置于4°C。在下游实验前，每只蜱用75%乙醇浸泡进行表面消毒，所有蜱均单独处理与检测。在体视显微镜下观察蜱标本的形态特征，包括盾板形态、基节结构、假头基形状和爪垫形态。通过与《蜱类系统学》中的描述进行形态比较来确定物种。
2.2. 蜱DNA提取
形态鉴定后，所有采集的蜱用75%乙醇洗涤三次以去除表面污染物。使用Isohair试剂盒严格按照制造商方案，从单个成蜱标本中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定提取DNA的浓度和纯度，DNA样本储存于-20°C直至下游分子分析。
2.3. 细菌性病原体PCR检测
用于扩增六种细菌病原体靶基因的引物由Azenta公司合成。引物序列、靶基因、退火温度和预期产物长度见文中表格。常规PCR在10 μL反应体系中进行。巢式PCR采用两步扩增方案在20 μL反应体系中进行。设立阴性对照。嗜吞噬细胞无形体、立克次体属、伯内特考克斯体和布鲁氏菌属的阳性对照为含有靶基因片段并经过Sanger测序验证的重组质粒。伯氏疏螺旋体 sensu lato 和土拉弗朗西斯菌则使用含有靶序列的合成质粒作为阳性对照。PCR循环条件为：95°C预变性5分钟；95°C变性30秒，特异性引物退火35秒，68°C延伸1分钟，共35个循环；最后68°C终延伸10分钟。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，根据预期产物大小判断结果。
2.4. 阳性PCR产物的克隆与测序
对每种靶病原体，所有PCR阳性样本均被选进行测序和系统发育分析，以确保检测结果的特异性并避免非特异性扩增。阳性样本的PCR扩增产物使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit纯化，随后使用pMD?19-T载体克隆试剂盒按照说明书连接到Escherichia coli DH5α感受态细胞。每个样本至少挑选三个阳性克隆，送至Genewiz进行Sanger测序。
2.5. 统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism 9.0进行。感染率以单个蜱为基础计算，所有比例的95%置信区间（95% CI）使用GraphPad Prism 9.0中的Wilson评分法确定。使用卡方检验和Fisher精确检验比较H. qinghaiensis 和 D. nuttalli 之间的病原体流行率差异，P值<0.05认为具有统计学显著性。
2.6. 序列与系统发育分析
通过色谱图分析手动校正测序结果，使用BLAST工具在GenBank数据库中进行同源序列搜索。使用MEGA X软件中集成的ClustalW算法进行多序列比对。使用MEGA X软件中的最大似然法（ML）和Kimura 2-参数（K2）模型构建系统发育树。进行1000次重复的自举分析，仅在节点显示值≥70%。基于序列同源性和系统发育聚类，对检出的病原体在属或种水平上进行初步分类。
3. 结果
3.1. 样本采集
2024年和2025年（4月至5月）共采集1025只游离蜱。所有采样点的地理分布和生境特征如图1所示。地图使用ArcGIS 10.8软件生成，标签指示了每个地点的蜱采集数量和优势生境类型。
3.2. 蜱种形态学鉴定
2024年采集803只蜱，2025年采集222只蜱。所有1025只游离蜱均为成蜱，未包含幼蜱或若蜱。所有蜱经形态学鉴定，归属于1科（硬蜱科）、2属（革蜱属和血蜱属）、4个物种：草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、青海血蜱（Haemaphysalis qinghaiensis）、森林革蜱（Dermacentor silvarum）和银盾革蜱（Dermacentor niveus）。其中，草原革蜱相对丰度最高，为66.83%（685/1025，95% CI: 63.92–69.61%）；其次为青海血蜱，占30.83%（316/1025，95% CI: 28.11–33.69%）；森林革蜱占1.95%（20/1025，95% CI: 1.27–2.98%）；银盾革蜱占0.39%（4/1025，95% CI: 0.15–1.01%）。这些蜱种在采样点（如刚察、门源、湟源等）的地理分布如图2所示，草原革蜱是刚察地区的优势种（648只），而青海血蜱主要集中在互助（196只）和化隆（3只）。森林革蜱和银盾革蜱在零星地点以少量被检出。青海血蜱、草原革蜱、森林革蜱和银盾革蜱的形态特征如图3所示。
3.3. PCR检测结果
本研究报告的所有感染率均以单个蜱为基础计算，未采用混合样本或基于地点的计算。使用病原体特异性引物进行的PCR扩增揭示了受测蜱种群中存在布鲁氏菌属（Brucella spp.）和立克次体属（Rickettsia spp.），详细检测结果总结于文中表格。受测蜱中布鲁氏菌属的总感染率为0.78%（8/1025，95% Wilson CI: 0.40–1.53%），所有阳性样本均检测自青海血蜱（2.53%，8/316，95% CI: 1.29–4.92%）；在草原革蜱中未检测到布鲁氏菌属（0/685，95% CI: 0.00–0.56%），两种蜱种间的感染率差异具有统计学显著性（Fisher精确检验，P < 0.001）。对于立克次体属，总感染率为16.29%（167/1025，95% CI: 14.16–18.67%），其中青海血蜱感染率为7.59%（24/316，95% CI: 5.16–11.05%），草原革蜱感染率为20.88%（143/685，95% CI: 18.00–24.08%）；两种蜱种间的差异具有统计学显著性（χ2= 27.41，df = 1，P < 0.001）。在任何受测蜱中均未检测到伯氏疏螺旋体 sensu lato、嗜吞噬细胞无形体、伯内特考克斯体或土拉弗朗西斯菌的扩增产物，表明在采样的游离蜱种群中未检出这些病原体。
3.4. 细菌性病原体的测序鉴定与系统发育分析
在1025份游离蜱DNA样本中，通过PCR扩增和序列比对，检测到两种立克次体（Rickettsia slovaca 和 Rickettsia raoultii）以及布鲁氏菌属。检测到的立克次体属分为两个簇：5株R. slovaca分离株（3.00%，5/167）均检测自青海血蜱，以及162株R. raoultii分离株（97.00%，162/167），其中143株来自草原革蜱，19株来自青海血蜱。根据系统发育树（图4），本研究的R. raoultii序列与来自中国西藏的R. raoultii分离株聚集在一个分支，序列一致性为99.20%至100%。
R. slovaca序列与来自青海牦牛的R. slovaca参考菌株以及来自新疆东亚家蝠肺/肾组织的菌株形成一个独立分支，序列一致性在96.97%至99.39%之间。这些结果表明，本研究的R. raoultii菌株与来自西藏的分离株在遗传上密切相关，而R. slovaca菌株在系统发育上接近来自青海和新疆的已知参考菌株。这暗示了这些立克次体物种在青藏高原及其周边地区可能存在区域遗传连续性。八份青海血蜱样本布鲁氏菌属检测呈阳性，对应于0.78%（8/1025）的总感染率。布鲁氏菌属的系统发育分析（图5）显示，本研究获得的四个序列与从伊拉克流产羊奶中分离的羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）共享>99.0%的核苷酸一致性。在草原革蜱、森林革蜱或银盾革蜱中未检测到布鲁氏菌属。
4. 讨论
青藏高原是一个独特的高海拔牧区生态系统，拥有丰富的有蹄类动物多样性和显著的蜱类活动。本研究对来自青海省10个地区的游离蜱进行了形态学鉴定，并对六种蜱传细菌病原体进行了分子筛查。研究结果揭示了这些蜱中存在立克次体属和布鲁氏菌属，为这一研究不足的高海拔地区的蜱传病原体提供了基线流行病学数据。共鉴定出硬蜱科2属（革蜱属和血蜱属）4种硬蜱，其中草原革蜱（66.83%）和青海血蜱（30.83%）为优势种。这与之前研究认为草原革蜱和青海血蜱是青海海东地区的优势蜱种的结论一致，进一步证实这两种蜱在青海草原生态系统中占主导地位。森林革蜱（1.95%）和银盾革蜱（0.39%）的相对丰度极低，这可能与采样环境密切相关。值得注意的是，两个采样年份地理覆盖范围和样本量的不一致可能导致潜在偏倚。本研究所有采集的蜱均为未吸血的游离成蜱。本研究的采样点主要为天然草原和人工牧场，而森林革蜱偏好针阔混交林或灌木生境，这可以解释其在青海东部捕获率低的原因。银盾革蜱主要分布在干旱和半干旱草原，采样点相对较高的湿度可能限制了其生存。从地理上看，草原革蜱在青海东部和西部地区均被高密度采集，因为该物种对低温和饥饿有很强的耐受性，并可寄生包括牦牛和绵羊在内的多种宿主。相比之下，青海血蜱主要集中在青海东部，这与之前报道一致，其对温度和湿度变化表现出更广的耐受性，通过在若虫阶段寄生小型哺乳动物完成其生命周期，这有助于其在农
