《Fermentation》：Optimization of pH and Temperature in a Simplified Peptone-Based Medium for Enhanced Recombinant Brazzein Expression in Pichia pastoris
Mariana Mu?oz-Santacruz,
Silvia Luna-Suárez,
Nelly Ramírez-Corona,
Aurelio López-Malo and
Jocksan I. Morales-Camacho
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本期推荐一篇关于高效生物合成天然甜味蛋白Brazzein的工艺优化研究。该工作针对重组Brazzein在毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33中的表达，成功开发并验证了一种成本更低、成分更简化的蛋白胨培养基(PSM)，替代了传统的复杂培养基。研究通过摇瓶和2 L生物反应器发酵，系统评估了接种量、pH和温度对细胞生长和蛋白产量的影响，发现pH 5.0、28°C为最优条件，使未纯化Brazzein产量达到0.422 g·L-1。尤为重要的是，作者构建了基于Monod和Luedeking–Piret方程的动力学模型，定量描述了生物量、底物消耗与蛋白产量之间的关系，为工艺理性设计和放大提供了预测框架，是推动下一代天然甜味剂工业化生产的重要进展。
1. 引言
全球范围内肥胖、糖尿病和龋齿等疾病的发病率不断上升，促使了对低热量、高甜度天然甜味剂的研究。其中，甜味蛋白因其不引发胰岛素反应而备受关注。Brazzein是目前已知最小的甜味蛋白，来源于西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillon的果实。它由54个氨基酸组成，包含4个二硫键，因此在高达80°C的温度和pH 2.5-8的范围内均能保持稳定，甜度约为2%蔗糖溶液的2000倍。这些特性使其成为食品工业的理想甜味剂。然而，从天然来源提取Brazzein的产量极低，因此需要借助异源表达系统进行规模化生产。已有研究在多种宿主中表达了Brazzein，其中毕赤酵母(Pichia pastoris)平台因具有强大的蛋白分泌能力和翻译后修饰功能，达到了目前报道的最高产量（0.345 g·L-1）。尽管如此，Brazzein尚未实现大规模的工业化生产，其商业化应用仍然有限。
毕赤酵母X-33是一种广泛用于重组蛋白生产的真核表达系统，其表达通常由甲醇诱导的AOX1启动子控制。该系统能够适应广泛的理化条件，但其重组蛋白生产率高度依赖于培养参数，如培养基组成、pH、温度、诱导剂浓度等。为了降低成本并提高工艺的可扩展性，开发简化的培养基至关重要。常用的甘油缓冲复合培养基(BMGY)虽然营养丰富，但成本高且成分不确定。相比之下，蛋白胨作为替代氮源，因其高生物利用度和代谢可及性而具有吸引力。此外，环境因素如pH和温度在重组表达中起着关键作用。pH影响蛋白折叠、胞外稳定性和蛋白酶活性，而温度则影响细胞死亡、能量代谢和蛋白质的正确折叠与分泌。因此，优化培养基并系统研究pH和温度的联合效应对于开发高效的Brazzein生产系统具有重要意义。
2. 材料与方法
2.1. 重组Brazzein
Brazzein基因由Gene Universal公司合成，并克隆到pPICZαA载体的XbaI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组质粒pPICZαA-Braz。通过热激法，用该质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) TOP10细胞。
2.2. 酵母毕赤酵母的转化
将制备好的毕赤酵母感受态细胞用含有质粒DNA、聚乙二醇(PEG)和氯化锂(LiCl)的混合物进行转化。转化后的细胞在含有25 μg·mL-1Zeocin的YPD琼脂平板上培养筛选，并通过菌落PCR验证转化子。
2.3. 种子液与培养基组成
将验证后的转化子接种到含有Zeocin的甘油缓冲复合培养基(BMGY)中，于28°C、160 rpm培养16小时，制备种子液。随后，基于Macauley等人描述的配方，配制了简化的蛋白胨培养基(PSM)，其成分为：40.0 g·L-1甘油、20.0 g·L-1蛋白胨、17.5 g·L-1磷酸氢二钾（pH 6.0）、12.0 mL微量元素溶液以及2.5×10-4g·L-1Zeocin。
2.4. 发酵条件
在摇瓶水平，评估了三种种子液接种量（5%， 10%， 15%）。发酵在175 mL锥形瓶中进行，工作体积为140 mL。培养温度为28°C，摇床转速为350 rpm。当培养物在约120小时达到OD600为2.0时，开始甲醇诱导。每次发酵总时长为240小时（120小时生长期+120小时诱导后阶段）。根据摇瓶结果，选择产量最高的条件（10%接种量）放大至2 L生物反应器，工作体积为50%。反应器操作条件为：pH 5.4-5.5（用2 M NaOH和2 M HCl控制）、28°C、350 rpm搅拌、1.0 vvm通气速率。
2.5. 发酵监测
在240小时的发酵过程中，每24小时取样一次，监测OD600和细胞干重(DCW)。在诱导后阶段，额外取样进行总蛋白定量和Brazzein分析。总蛋白通过BCA法测定。Brazzein的监测采用改进的Tris-Tricine SDS-PAGE系统（16%丙烯酰胺分离胶），并使用考马斯亮蓝染色。通过凝胶成像系统和Image Lab软件进行密度测定分析，使用牛血清蛋白(BSA)标准曲线对Brazzein进行半定量评估。
2.6. 生物反应器中细胞生长与Brazzein生产的优化
采用两水平因子设计（22）评估pH（5.0-6.0）和诱导温度（20-28°C）对Brazzein生产的影响。除了四个因子组合外，还包括一个参考条件（pH 5.5, 25°C）用于基准测试和评估实验变异性。在2 L生物反应器中进行总共六次独立运行。在生长期，pH维持在5.5，温度为28°C。120小时后，用2%甲醇开始诱导，并根据实验设计调整温度和pH。
2.7. 统计分析
三次取样获得的数据通过方差分析(ANOVA)进行评估，以检验处理均值间的显著差异。若检测到显著效应，则应用Tukey多重比较检验识别组间差异。显著性水平设为p < 0.05。
2.8. 模型建立
基于生物量、底物浓度、重组蛋白生产和系统体积的质量平衡方程，构建了描述发酵过程的动力学模型。该模型借鉴了?elik和Panchiga等人的通用建模策略，并根据本研究的实验条件和诱导曲线进行了调整。模型参数部分来源于文献和初步实验设定，部分通过模型校准进行估计。模型方程包括生物量变化、底物（甘油和甲醇）消耗等动力学描述。
3. 结果与讨论
3.1. 简化蛋白胨培养基与接种量评估
在摇瓶发酵中，使用简化的蛋白胨培养基(PSM)评估了三种接种量（5%， 10%， 15%）。结果表明，PSM培养基能够支持毕赤酵母X-33的稳健生物量生长。在10%接种量条件下，细胞生长和Brazzein产量表现最佳。因此，选择10%接种量进行后续的生物反应器放大实验。
3.2. 生物反应器放大与产量
在2 L生物反应器中，使用PSM培养基和10%接种量进行放大发酵。经过216小时的诱导，获得了0.196 g·L-1的Brazzein产量。这一结果证实了PSM培养基在生物反应器规模上支持高效生物量生长和重组蛋白表达的潜力，是传统复杂培养基的一种经济有效的替代方案。
3.3. pH与温度的优化
通过两水平因子设计，系统研究了pH和温度对Brazzein生产的影响。实验数据表明，pH和温度对Brazzein产量具有显著影响。在测试的条件中，发酵在pH 5.0和28°C下进行时，获得了最高的未纯化Brazzein浓度，达到0.422 g·L-1。较低的pH可能有助于抑制蛋白酶的活性，从而减少重组蛋白的降解。而28°C的较高温度则可能促进了细胞的代谢活性和蛋白合成速率。这一优化结果为Brazzein的高效生产确定了关键的环境参数。
3.4. 动力学模型
研究建立了基于Monod方程的动力学模型，成功描述了生物量形成、底物（甘油和甲醇）消耗与Brazzein生产之间的关系。模型拟合良好，能够捕捉发酵过程中各变量的动态变化。通过模型，可以量化比生长速率、底物消耗系数和产物形成系数等关键动力学参数。这为理解毕赤酵母表达Brazzein的生理特性和代谢行为提供了深入的见解，并为未来工艺的理性设计、优化和进一步放大提供了可预测的框架。
4. 结论
本研究成功开发并验证了一种用于毕赤酵母X-33表达重组Brazzein的简化蛋白胨培养基(PSM)。该培养基在降低成本和复杂性的同时，保持了高效的生物量形成和蛋白分泌性能。通过摇瓶和生物反应器实验，确定了10%的接种量为适宜条件。更重要的是，通过系统优化，发现pH 5.0和28°C是最大化Brazzein产量（0.422 g·L-1）的关键环境参数。此外，所建立的动力学模型有效关联了生长、底物利用和产物形成，为工艺的深入理解和规模化放大提供了理论依据。这项工作整合了培养基简化、生物反应器验证和动力学建模，超越了传统的经验优化，为甜味蛋白等具有工业潜力的重组产物的高效、可扩展生产提供了一套具有预测性的策略。
