《Applied and Environmental Microbiology》：Coexistence process and driving factors of arbuscular mycorrhizal fungi in urban green soil under heavy metal stress
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本项研究聚焦于快速城市化进程中，城市绿地土壤面临的严峻重金属污染问题及其对关键土壤微生物——丛枝菌根真菌（AMF）群落构建过程的影响。研究以郑州市为案例，通过多梯度采样与高通量测序，揭示了重金属（特别是铁和锌）是塑造AMF群落结构的关键驱动因子，并首次阐明了在该环境中，专性AMF的组装主要由确定性过程主导，而广性AMF则受随机性过程支配。这些发现为理解城市生态系统微生物对环境胁迫的响应机制提供了新见解，对城市绿地土壤健康管理和生态系统功能维持具有重要科学价值。
引言：城市化进程中的土壤隐忧
在近几十年来，重金属污染已成为全球关注的环境问题。城市绿地作为城市中具有多重污染源的生态系统，其土壤重金属污染往往较为严重。高浓度的重金属对微生物具有毒害作用，会导致微生物群落结构发生改变。重金属（类金属）即使在低浓度下也能在微生物体内积累，导致细胞结构损伤、代谢紊乱以及蛋白质、DNA等分子变性。因此，重金属被认为是影响土壤微生物种群和群落结构的主要非生物胁迫因子之一，特别是对于与超过80%的维管植物存在共生关系的丛枝菌根真菌（AMF）。AMF能够改善植物对养分和水分的吸收，并可通过植物稳定化作用将重金属固定在植物根部，从而充当污染物的屏障。研究表明，与AMF共生的植物在重金属污染土壤中比非菌根植物表现出更优的生长性能、更高的重金属耐受性和生物量积累能力。然而，过量的重金属对大多数AMF具有毒性，只有那些具有高耐受性的种类能够存活，从而导致AMF多样性降低。因此，研究重金属（HMs）影响下城市绿地土壤中AMF群落多样性的变化，并进一步探讨AMF响应重金属污染的机制，对于城市绿地生态系统管理至关重要。理解微生物群落构建中确定性过程和随机性过程的相对贡献是微生物生态学的主要目标之一。迁移和扩散在塑造随机性过程中起着重要作用，而确定性过程则由物种性状、生物相互作用和环境过滤驱动。重金属胁迫下的微生物群落构建机制对于塑造生物多样性和群落组成起着至关重要的作用。微生物群落受到重金属施加的强烈选择压力。重金属施加的环境选择压力导致生物同质化增加，从而削弱了随机过程在AMF群落构建中的影响。目前，对于重金属污染的城市绿地土壤中AMF群落如何组装，特别是基于生态位宽度的专性和广性类群，仍不清楚。理解维持AMF群落组装的基本机制，对于把握这些生态系统中微生物群落如何响应并与重金属污染相互作用至关重要。
本研究以中国中原地区发展最快的城市之一——郑州为研究区域，调查了沿城乡梯度60个绿地样点的AMF群落分布格局和土壤污染物状况。具体目标为：(i) 评估不同城市化水平下土壤条件和重金属的变化与水平；(ii) 分析土壤AMF群落对此梯度的反应；(iii) 探究重金属污染存在下，城市绿地土壤中AMF群落的组装过程及其影响因素。
材料与方法：多梯度采样与深度分析
研究在中国中部的郑州市进行，总面积7567.18平方公里，市区面积1078.07平方公里。该市地处暖温带与亚热带过渡区，属典型的暖温带大陆性季风气候，1月平均气温2.42℃，8月平均气温25.9℃，年平均降雨量690毫米。植被类型为暖温带落叶阔叶林，样地内常见绿地植物包括悬铃木、梧桐、银杏、女贞、国槐等。研究从郑州市中心（二七区）出发，沿东、西、南、北四个方向设置了宽3公里的调查样带。在样带内的城市绿地中，共设立了60个样地，每个样地至少间隔1公里。根据城市发展环线，将60个地点分为四组：市区13个、近郊14个、远郊21个、乡村12个。市区定义为二环内区域；近郊为二环与三环之间；远郊为三环与四环之间；四环外区域为乡村。在每个10×10米的样地内，选择三个采样点采集植物根区土壤。清除表层凋落物和砾石后，采集0-20厘米深度的植物根际土壤。将三个点的土壤过2毫米筛混合，构成每个样地的复合样本。混合样品分为两份，一份保存于-80℃用于测序，另一份保存于4℃用于土壤理化性质分析。测定的土壤理化性质包括土壤有机质（SOM）、速效磷（AP）、土壤含水量（SMC）、速效钾（AK）、土壤pH值和全氮（TN）。使用原子吸收分光光度计评估土壤中的重金属镉、锌、铁、铜和铅。使用Fast DNA SPIN Extraction Kit提取土壤样品总AMF DNA，并利用AMF特异性引物对AMF的核糖体内转录间隔区（ITS）区域进行扩增。扩增产物在Illumina MiSeq平台上进行测序。使用QIIME软件处理原始序列数据，基于97%的相似性将非冗余序列归类为操作分类单元。利用基于莱文斯生态位宽度的方法评估AMF的生境专性，将AMF群落划分为广性种和专性种。通过β最近分类单元指数评估随机和确定性过程在AMF群落组装中的相对重要性。βNTI值在-2和2之间表明随机过程主导，小于-2或大于2则表明确定性过程主导。进一步使用中性群落模型评估随机过程对AMF群落组装的影响。
结果：重金属分布、群落结构与组装机制
土壤条件与重金属浓度
对60个土壤样品的评估结果显示，与城市土壤相比，乡村土壤质量更好，具有更高的速效磷、pH、土壤含水量值和重金属水平，以及更低的土壤有机质。土壤有机质沿城乡梯度的差异显著。郑州市城市绿地土壤中五种重金属的平均含量均高于河南省土壤背景值。具体而言，镉和锌的浓度随与城市中心距离的增加而增加，内梅罗综合污染指数（Pn）值也随距离增加。研究观察到铁与全氮呈正相关，与pH值呈负相关。铜与pH值呈正相关。n随与城市中心距离的增加而增加。热图展示了金属与土壤条件及植物丰度之间的关系。">
AMF群落组成结构
基于生态位宽度指数，36个OTU被鉴定为广性种，186个OTU被归类为专性种。AMF群落组装的非度量多维尺度分析表明，在四个城市化水平上，三类类群（全部物种、专性种、广性种）的物种组成存在差异。与专性种和所有城市化类别共享的物种相比，广性种共享的OTU比例更高。AMF在属和种水平上的比例沿城乡梯度变化。值得注意的是，球囊霉科中的Glomus_f_Diversisporaceae仅存在于乡村地区。随着与城市中心距离的增加，全部物种、专性种和广性种中球囊霉科Glomus_f_Glomeraceae的比例先增加后逐渐减少，在远郊地区比例最大。在种水平上，Glomus-Glo16-VTX00120仅存在于乡村地区。未分类的Glomeromycetes纲、Glomus-MO-G23-VTX00222和未分类的Diversispora属在近郊和乡村地区比例相对较低，而在市区和远郊比例相对较高。
AMF群落多样性
稀疏曲线分析表明，随着检测序列数的增加，丰富度达到平台期，表明大部分AMF序列已被捕获。多样性指数显示AMF群落对重金属的响应各异。具体而言，锌与AMF群落的香农多样性呈正相关，但与丰富度指数呈负相关，而镉和铜与AMF群落呈正相关。曼特尔检验结果显示，仅锌与全部三类群落均呈显著相关。在六个类中，Acaulosporawith与香农多样性呈正相关，但与重金属无显著相关。未分类的Glomeromycetes纲与重金属和香农多样性均呈负相关。Scutellospora和球囊霉科Glomus_f_Glomeraceae与两者均呈正相关，而其他两个属则无显著关系。
AMF群落的组装过程与驱动因子
分析结果显示，全部物种和专性种的βNTI值大于2。相比之下，广性种的βNTI值在-2到2之间。这些结果表明，随机过程主要驱动广性种的组装，而全部物种和专性种的组装则主要由确定性过程主导。中性群落模型有效捕捉了OTU出现频率与其相对丰度之间的关系，其R2值分别解释了全部类群、广性类群和专性类群群落变异的37.3%、34.5%和65.5%。此外，分别有67.42%、61.11%和74.2%的OTU被预测遵循中性分布。与全部类群和专性类群相比，在广性类群中观察到了更高的m值。这一发现表明，由于更强的扩散限制，全部和专性群落的迁移能力较弱。因此，随机过程在所有类群和专性类群的组装中作用较小，表明确定性过程主要驱动群落组装。这些发现与零模型分析结果一致。线性回归分析结果显示，Pn的变化与βNTI呈显著正相关；铁与βNTI呈显著负相关，而锌在三类类群中与βNTI呈正相关。这些发现表明，重金属污染显著塑造了该区域的微生物群落组成，其中专性种主要受随机过程驱动。n在所有、广性和专性群落中均呈现显著线性相关。">
讨论：机制阐释与生态启示
不同城市化水平下的重金属浓度变化
本研究发现，重金属浓度和土壤理化性质因城市化水平不同而存在差异。土壤有机质随与城市中心距离的增加而减少，这一发现与之前的研究相似。城市土壤的全氮水平高于近郊、远郊和乡村地区，这可能是由于氮肥和动物的绿色施用，以及机动车尾气中含氮化合物的沉积所致。所有重金属的浓度均显著超过郑州市土壤背景值。在本研究中，除铅外，重金属含量和综合污染指数通常随与城市中心距离的增加而降低，这与李等人的研究相反。在农业土壤中，重金属会以难溶性形式积累，渗入土壤溶液，最终危害地下水和作物品质。长期反复施用含金属的农药、化肥和杀菌剂会导致重金属逐渐积累，使土壤中达到潜在有害水平。因此，在城市绿地背景下，近郊和乡村地区的重金属污染物浓度往往高于市区。斯皮尔曼相关性分析显示，重金属与全氮、pH值等土壤性质之间存在显著相关性，这可能是由于土壤物质抑制了重金属的迁移。许多研究报告称，土壤结构、阳离子交换容量和电导率对重金属在土壤中的迁移也有重要影响。重金属可与有机质结合形成固体化合物，从而固定在土壤中。土壤pH值通常调节重金属与吸附剂（包括溶解性有机质与铜、镉、锌、镍、铅、铬、铁、锑和砷在土壤溶液中的络合）之间的吸附相互作用。结果表明，全氮和pH值是影响城市绿地生态系统中重金属分布的重要因素。
重金属对AMF群落结构和多样性的影响
土壤AMF多样性分析显示，锌与总物种丰富度呈负相关，而镉与专性种的香农多样性指数呈正相关。锌含量升高会降低耕地土壤中细菌群落的多样性，而锌污染是影响微生物群落结构的重要因素。镉污染可能会降低AMF群落中广性种的多样性，同时提高专性种的多样性。未分类真菌在未污染地点最为丰富，与土壤锌污染呈负相关。因此，重金属锌和镉是影响城市绿地生态系统AMF多样性和群落结构的重要因素。群落分析结果显示，球囊霉科是真菌在城市化水平上的优势类群，且在远郊地区比例最高。将远郊与其他地区比较后发现，远郊的铜含量高于其他地区。这可能是AMF在铜污染环境中的生存策略所致。有研究报告了在此类环境中存在蓝绿色真菌孢子，并发现真菌群落中蓝绿色孢子的比例随铜污染增加。此外，积累了铜的孢子是无活性的，这表明了真菌在铜污染环境中的生存策略之一。对不同生境（包括农业土壤）中AMF多样性的调查经常报告球囊霉属的优势地位。与我们的结果相似，克里希纳穆尔蒂等人报告了在重金属污染地点球囊霉属占主导地位。然而，与其他需要孢子萌发的AMF物种不同，球囊霉分离物可以利用根片段和菌丝作为有效的繁殖体。由于球囊霉菌株具有强烈的菌丝融合趋势，它们能够扩展其根外菌丝网络，从而促进更有效的资源分配。这种现象可能是球囊霉属在本研究中成为最优势属的原因。
重金属对广性与专性群落构建的影响
βNTI分析表明，在城市绿地生态系统内，随机过程在塑造广性群落的组装中比确定性过程发挥了更大的作用。这一发现与之前的研究一致，即广性种的分布主要受中性过程影响，因为它们受栖息地条件变化的影响较小。相比之下，物种筛选（确定性过程）对栖息地专性种的影响更大，因为它们适应特定的环境条件。此外，中性群落模型结果表明，随机过程在广性群落的组装中比确定性过程发挥着更重要的作用。相比之下，确定性过程在城市绿地生态系统中专性群落的组装中比随机过程更为重要。这种差异可能归因于栖息地异质性和环境胁迫的变化。在温带城市绿地中，确定性过程主导专性种的群落组装，而随机过程驱动广性种的组装。我们的研究结果进一步揭示了重金属与广性和专性种的βNTI值之间存在强关联。这表明重金属在调节城市绿地中广性和专性种的随机与确定性组装过程之间的平衡方面起着关键作用。先前的研究已确定土壤化学是影响许多不同环境中土壤AMF群落组装过程的关键因素，例如pH值、有效硫、有机质和铵态氮。广性种和专性种之间的权衡在决定群落适应新环境的潜力方面起着重要作用。对于广性种，随机组装过程可被视为适应潜在未来环境变化的一种手段。这可以解释为，重金属是影响城市绿地生态系统中广性物种和专性物种群落构建的重要因素。
结论
本研究考察了AMF群落对土壤因素（重点是重金属污染）的响应，并探讨了微生物群落结构背后的生态机制。研究发现，近郊和乡村地区的重金属污染物浓度通常高于市区，全氮和pH值是影响城市绿地生态系统中重金属分布的重要因素。值得注意的是，广性群落的组装主要由随机过程驱动，而确定性过程对专性群落的影响更大。此外，重金属在指导AMF群落组装中起着至关重要的作用，尤其是锌和铁。总之，这项研究为理解AMF群落如何响应胁迫环境提供了有价值的见解，进一步丰富了我们对城市绿地内土壤微生物生态学的认识。
