《Current Issues in Molecular Biology》：ABT Promotes Adventitious Root Formation in Mulberry Cuttings by Coordinating Hormonal Homeostasis and Defense Priming
Zhen Qin,
Tiantian Wang,
Ziyi Song,
Hao Dou,
Chaobing Luo,
Xiu Zhang,
Huijuan Sun,
Bingyang Zhang,
Yaru Hou and
Zhaojun Liu
+ 3 authors
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本文探讨了复合型生根促进剂ABT（含20% NAA和30% IAA）如何通过重塑桑树插条激素稳态、协调细胞壁重建与预激活防御状态，来克服其不定根形成效率低的瓶颈，为林木无性繁殖中平衡根诱导与防御反应提供了新的概念框架。
1. 引言
扦插是木本植物无性繁殖的关键方法，但不定根(AR)形成效率低是许多木本物种的主要瓶颈。桑树(Morus alba)作为一种重要的经济林木，其扦插繁殖就受到此限制。尽管复合型生根促进剂ABT能提高插条存活率，但其分子机制尚不清楚。植物生长调节剂被广泛用于促进扦插繁殖。ABT（含20% NAA和30% IAA）等配方在特定条件下可显著改善生根表现。桑树通常被认为是难生根物种，而ABT处理可明显促进其不定根形成。本研究旨在通过转录组分析，阐明ABT促进桑树插条不定根形成的分子基础，重点关注激素信号、细胞壁重塑和防御相关反应。
2. 材料与方法
2.1. 实验地点、植物材料与实验设计
实验在河南农业大学第三生活区的温室进行。选用桑树品种‘强桑1号’(Morus spp.)的当年生半木质化枝条作为插穗。插穗基部在浓度为200、500、800或1000 mg/L的ABT、IAA或NAA溶液中浸泡30秒；对照(CK)插穗浸泡在蒸馏水中。在扦插后第0、10、20和30天，分别从CK和ABT处理（1000 mg/L）插穗的基部区域（切口表面上方约1厘米）采集皮层组织样本，用于转录组分析。生根阶段记录为：愈伤组织形成（扦插后0-10天）、根原基诱导（10-20天）和不定根出现（20-30天）。在第30天，记录各组的根数、根长等数据。
2.2. RNA测序
总共构建了24个RNA测序文库（2种处理 × 4个时间点 × 3个生物学重复）。总RNA使用TRIzol试剂提取，文库构建和测序由北京百迈客生物科技有限公司在Illumina HiSeq 2500平台上进行。
2.3. 序列比对与RNA-Seq数据分析
将原始读数过滤后得到高质量清洁读数，并比对到桑树(Morus notabilis)参考基因组。使用DESeq2进行差异表达基因(DEG)分析，阈值设定为|log2(FC)| ≥ 1且错误发现率(FDR)校正的p值 ≤ 0.05。使用KEGG和GO数据库对DEG进行功能富集分析。
2.4. 加权基因共表达网络分析
使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)来探索基因间的表达相关性模式，以log2(FPKM + 1)值作为输入。根据无标度拓扑标准确定软阈值功率，并使用动态树切割方法将基因聚类到模块中。
2.5. 通过RT–qPCR验证DEG
通过RT-qPCR对四个选定的关键基因的表达水平进行定量，以验证转录组数据。以肌动蛋白基因作为内参，使用2?ΔΔCt法计算相对表达水平。
3. 结果
3.1. 不同激素对桑树插条不定根生长的影响
结果表明，与对照相比，用不同浓度（200–1000 mg/L）的ABT、NAA或IAA处理可显著提高桑树插条的生根率、平均根数和平均根长。双向方差分析显示，激素类型、浓度及其相互作用对所有三个生根参数均有显著主效应(p < 0.05)。在ABT处理中，1000 mg/L产生了最高的生根率(59.42%)、最多的平均根数(11.33)和最长的平均根长(8.63 cm)。基于这些结果，确定ABT、NAA和IAA的最佳浓度分别为1000 mg/L、800 mg/L和1000 mg/L，且ABT对不定根形成的促进作用显著强于NAA或IAA。
3.2. 高通量基因表达谱分析
为了阐明ABT促进桑树不定根形成的分子基础，我们进行了RNA-seq以鉴定差异表达基因(DEG)。实验包括四个ABT处理组（ABT-1/2/3/4，分别在0、10、20和30天取样）和四个相应的对照组。主成分分析(PCA)显示，在第0天，ABT-1和CK-1之间明显分离，表明ABT在早期诱导了显著的转录组变化。使用|log2FC| > 1和FDR校正p < 0.05的阈值，我们分别在0、10、20和30天鉴定出3630、509、1720和540个DEG。多组分火山图总结了跨时间点的差异表达。在第0天，1598个基因上调，2023个基因下调。在第10天，259个基因上调，250个基因下调。值得注意的是，与生长素稳态和次生细胞壁形成有关的WAT1，以及通过JA-Ile羟基化参与茉莉酸信号衰减的CYP94C1表现出显著的差异表达。在第20天，1238个基因上调，482个基因下调；突出的候选基因包括据报道通过细胞壁松弛促进根伸长的EXPA11，与能量代谢相关的BAT1，以及参与活性氧(ROS)产生并与防御和发育调节相关的NADPH氧化酶RBOHB。在第30天，322个基因上调，218个基因下调。
3.3. 加权基因共表达网络分析
通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定了12个共表达模块(ME1–ME12)。模块-处理关联分析显示，ME8和ME9与ABT-1（第0天）相关性最强，ME12与ABT-3（第20天）相关性最强。模块间相关性分析显示，ME3、ME4和ME5之间存在显著正相关，ME7、ME8和ME9之间也存在显著正相关，而ME1和ME11呈负相关。基因本体(GO)富集分析将模块基因分为分子功能、生物过程和细胞成分类别，所得的功能网络将富集术语分为四个领域：细胞分裂和分化调节、激素信号转导、能量和代谢支持以及环境胁迫/防御反应。值得注意的是，ME8和ME9在ABT-1中相对于CK-1上调，并富集了与细胞分裂/分化、激素信号和胁迫/防御反应相关的术语。相比之下，ME3主要与能量和代谢过程相关，并在第20天表现出最强的表达差异，与不定根的出现和伸长相吻合，表明代谢支持可能对ABT诱导的生根有贡献。
3.4. ABT对植物内源激素的影响
植物激素是扦插繁殖的关键调节因子。基于差异表达基因(DEG)和KEGG富集结果，我们重构了激素相关信号通路图。
在生长素信号通路中，生长素流入载体基因AUX1在第3-4期上调。TIR1在第1-2期下调，但在第3-4期转为上调。大多数AUX/IAA基因在整个时间过程中持续上调。ARF在第1期下调，在第2期上调。此外，一个GH3基因在第1期和第3期被显著诱导，而一个SAUR基因在第1期被显著诱导。
在细胞分裂素信号通路中，三个B-ARR基因在第1期上调，并且B-ARR转录本在第3期被广泛诱导（不同程度）。此外，一个A-ARR基因在第1期被显著诱导，并且A-ARR基因在第2期上调。
在赤霉素(GA)信号通路中，一个GID2基因在第1期显著上调，并在随后的时期保持诱导状态。在DELLA基因中，一个在第1期显著下调，三个在第1-2期上调，另外三个在第3期被显著诱导。此外，三个转录因子(TF)基因显著上调，分别在第1、2、3期各有一个被诱导。
在脱落酸(ABA)信号通路中，所有PYR/PYL基因在第3期均上调。此外，两个ABF基因在第1期下调，随后在后期逐渐增加。
在乙烯信号通路中，EBF1/2基因在第2期上调，但在第3-4期下调。两个ERF1/2基因在第1期表现出相反的调节（一个下调，另一个上调），并在随后的时期呈现先增后减的模式。
在油菜素内酯(BR)信号通路中，一个基因在第1期上调，而两个基因在第3-4期上调。
在茉莉酸(JA)信号通路中，大多数JAZ基因在第1期下调，在第2期上调，此后下降。几个MYC2基因表现出相似的模式，在第1期下调并在第2期上调；然而，一个MYC2基因在第1期被显著诱导。
在水杨酸(SA)信号通路中，NPR1在第2期上调，但在其他时间点下调。三个TGA基因在第1期被显著诱导，一个TGA基因在第3期被显著诱导。三个PR-1基因在第2期显著下调，但在第1、3和4期显著上调。
3.5. ABT对植物-病原体互作的影响
在扦插繁殖过程中，伤口表面直接暴露于外部环境；因此，插条的转录防御状态可能影响生根成功率。为了研究这一点，我们对差异表达基因(DEG)进行了KEGG富集分析，并重构了病原体相关通路图。总体而言，防御相关基因在四个阶段表现出强烈的时间动态。
大多数CNGC基因在第2-3期上调，而只有一个成员在第1期被显著诱导。CAM/CML基因被广泛诱导，所有成员在第1期上调，九个在第2期，四个在第3期被显著诱导，一个在第4期被诱导。WRKY25/33基因主要在第1-2期上调，但在第3-4期被抑制或恢复至基线水平。WRKY22/29和FPK1通常在第1和3期表现出诱导。所有三个PR1基因在第1、3和4期上调，但在第2期下调。大多数EIX1/2基因在所有阶段均表现出不同程度的上调，而所有三个CEBiP基因在第3期被诱导。PTO基因在第2期上调，PTI5在第1期被显著诱导但在第3期被显著抑制；两个PTI6基因均在第2期被诱导。所有RPM1基因在第1-3期上调，一个HSP90A基因在第1期被诱导。RPS2基因表现出异质模式：四个在第1-2期上调并在第3-4期下调，两个在所有阶段持续上调，一个在第1-2期下调但在第3-4期上调。在UPA20中，一个基因在所有阶段持续上调，另一个持续下调。两个RRS1-R基因在第1、2和4期上调，但在第3期下调。对于WRKY1/2，三个基因在第1-2期被诱导，一个基因在第1和3期被诱导。
4. 讨论
我们的结果表明，ABT处理伴随着激素相关信号通路的显著转录重编程。与杨树和拟南芥中的报道一致，维持生长素稳态被广泛认为对成功的不定根(AR)起始至关重要。我们检测到GH3在创伤阶段（第0天）和根原基出现阶段（第20天）均显著上调。这种模式与GH3在将游离IAA结合到氨基酸上，从而限制过量的生长素积累并减少潜在生长素毒性的既定作用一致，这可能有助于创造一个有利于根原基分化的激素环境。
值得注意的是，ERF1/2表现出时间振荡，早期增加随后抑制。这一观察结果为乙烯信号在不定根形成中阶段依赖性作用提供了转录支持：适度的早期激活可能促进伤口反应和细胞重编程，而后期下调可能解除抑制约束并利于根伸长。这种动态表明ERF1/2可以作为整合发育程序与防御相关转录反应的调节节点。
此外，JAZ基因（茉莉酸信号抑制子）的早期下调，连同根原基诱导期间（第10天）CYP94C1的上调，表明ABT调节了茉莉酸相关信号的激活和随后的衰减。这为解释茉莉酸在易生根与难生根物种中上下文依赖性的作用提供了一个潜在的框架：ABT可能瞬时增强茉莉酸信号以启动伤口反应，随后通过CYP94C1介导的JA-Ile转换来防止可能阻碍生根的持续信号。
在细胞结构水平上，我们的结果扩展了当前对不定根形成过程中细胞壁重塑的理解。根原基出现期间（第20天）EXPA11的强烈诱导，连同多个与细胞壁刚性相关基因的下调，支持了细胞壁松动有利于原基向外生长的观点。这种模式与生长素驱动的细胞膨胀一致。
本研究的一个关键贡献是细胞壁重塑与防御预激之间的时空联系。PR-1在几个关键阶段（第0、20和30天）的持续上调，以及WRKY转录因子和RPM1等防御相关调节因子的协调表达，表明ABT可能在转录水平上预激活植物防御通路以应对潜在的病原体挑战。这种结构重塑与防御相关转录激活的耦合可能部分解释了ABT处理插条性能改善的原因。
通过WGCNA构建的共表达网络进一步将激素信号、防御反应和能量代谢整合到一个工作系统中。从ME8/ME9模块（早期（0天）富集激素和防御通路）到ME3模块（后期（20天）主导能量代谢）的时间转换，表明ABT调节中存在明确的阶段特异性优先级。根原基出现期间关键基因BAT1（能量代谢）和RBOHB（ROS产生）的协调上调具有功能意义：BAT1为细胞分裂和伸长提供能量，而RBOHB产生的ROS可能作为第二信使进一步放大防御信号，并可能参与细胞壁松动。从系统生物学角度来看，这种“能量-防御”网络的有效整合，可能是ABT在测试条件下优于单一生长素所观察到的优势的基础——它表明了在资源有限条件下，发育、防御相关和代谢转录反应之间的协调。
5. 结论
本研究增进了我们对复合生长调节剂在生根过程中如何发挥作用的理解。我们的数据表明，ABT与不定根形成过程中能量相关调节的转变有关，这可能是通过协调的茉莉酸信号衰减（通过CYP94C1）和防御预激（例如PR-1/WRKY）介导的。这些结果为茉莉酸在难生根物种中上下文依赖性的作用提供了相关的转录组证据。此外，ERF1/2的振荡表达暗示了阶段特异性的乙烯调节，并可能有助于发育和防御程序之间的转换，从而扩展了当前关于不定根形成过程中时间性乙烯控制的概念。
基于这些发现，我们提出了一个三级调节框架——“激素稳态-细胞壁重塑-防御预激”，以解释林木克隆繁殖过程中根诱导与防御相关反应之间的协调。然而，本研究受限于其聚焦于皮层组织的转录组动态；未来的工作应纳入空间分辨验证（例如原位方法或空间转录组学）以定位细胞类型特异性表达。此外，ABT中IAA和NAA成分之间的相互作用仍有待阐明，可能通过使用激素相关突变体进行遗传分析来实现。尽管存在这些局限性，本文鉴定的关键模块（例如ME3/ME8/ME9）和候选基因（EXPA11、BAT1和RBOHB）为桑树改良提供了有前景的分子靶点，所提出的模型可能为增强其他林木物种的无性繁殖工作提供信息。
