《Journal of Bacteriology》：Characterization of the cell division-associated peptidoglycan amidase AmiA of Chlamydia trachomatis
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这篇综述深入揭示了沙眼衣原体(C. trachomatis)在无典型肽聚糖(PGN)囊壁的情况下，如何利用其唯一的细胞分裂酰胺酶AmiA_Ct来调控瞬时存在的肽聚糖环，从而驱动其独特的FtsZ非依赖性极化出芽分裂过程。研究结合体外生化实验、异源互补和胞内CRISPRi基因敲低技术，证实了AmiA_Ct作为单一功能酰胺酶的关键作用，其活性缺失会导致衣原体形态异常、分裂受阻、感染性EB减少及PGN累积，强调了PGN合成、重塑与回收在胞内病原体增殖中的精妙平衡与重要作用。
沙眼衣原体细胞分裂相关肽聚糖酰胺酶AmiA的功能表征
引言
衣原体属(Chlamydia)细菌是重要的专性胞内病原体，在全球范围内引起严重的呼吸道和性传播感染。在其发育周期中，衣原体在两种形态不同的形式间转换：无感染性、分裂的网状体(RBs)和有感染性、不分裂的原体(EBs)。与其他细菌不同，致病性衣原体物种缺乏一个完整的肽聚糖(PGN)囊壁，但会在RB的极化分裂过程中，在分裂体(divisome)部位合成一个短暂且局部的PGN结构。尽管已有研究描述了衣原体分裂体中在膜上特定部位生成PGN所需的组件，但对于PGN结构如何被降解以允许子细胞形成并完成分裂过程，人们知之甚少。酰胺酶是模式细菌细胞壁中的关键组分，它们催化PGN的降解和重塑，包括在分裂隔膜处。本研究旨在表征沙眼衣原体(C. trachomatis)细胞分裂相关酰胺酶AmiA_Ct的功能。
沙眼衣原体编码一个AmiA同源物
生物信息学分析表明，沙眼衣原体血清型D的ct268基因（血清型L2中为ctl0520）编码的蛋白，与肺炎衣原体(C. pneumoniae)的细胞分裂酰胺酶AmiA_Cp有59%的氨基酸序列同一性，与大肠杆菌(E. coli)的AmiA (AmiA_Ec)有36%的同一性。该蛋白被指定为AmiA同源物，以下简称AmiA_Ct。与大肠杆菌AmiA_Ec相比，衣原体AmiA同源物的催化中心持续暴露，且缺少抑制螺旋结构，暗示衣原体酰胺酶可能处于默认激活状态，其活性调控机制仍是未知的。与双功能的AmiA_Cp不同，AmiA_Ct仅保留一个SxN PBP基序，该基序与PBP活性无关。序列分析预测AmiA_Ct具有信号肽，可能通过Sec途径分泌到周质空间。
功能实验证实了AmiA_Ct的活性。在大肠杆菌中过量表达野生型AmiA_Ct会导致产生菌株裂解，而突变催化位点残基H67、H136或E205则可挽救细菌生长，表明这些残基对酶活性同等重要。此外，在酰胺酶缺陷型大肠杆菌突变株(ΔamiABC)中，诱导表达AmiA_Ct能够部分恢复单细胞表型，支持细胞分离，证明AmiA_Ct在游离细菌中具有功能，可能通过降解PGN辅助细胞分离。
AmiA_Ct在体外对PGN和前体分子lipid II具有酰胺酶活性
为了验证纯化AmiA_Ct的体外功能，研究人员使用雷马唑亮蓝染色PGN(RBB-PGN)作为底物进行染料释放实验。与预测一致，AmiA_Ct在体外能够水解PGN，而催化位点突变体(H67A)则没有活性。酶反应效率具有pH依赖性，在碱性条件(pH 8.5和pH 9.5)下活性最高。此外，还测试了野生型或H67A突变体AmiA_Ct对PGN前体lipid II mDAP的活性。薄层色谱(TLC)结合质谱(MS)分析表明，AmiA_Ct对lipid II mDAP具有单功能的酰胺酶活性，需要完整的活性位点，能够从未癸烯基-焦磷酸-MurNAc-GlcNAc上释放肽侧链。AmiA_Ct未表现出像其同源物AmiA_Cp那样的羧肽酶活性。综上所述，纯化的AmiA_Ct在体外可水解PGN和lipid II mDAP，是一种单功能酰胺酶。
AmiA_Ct与PGN的结合独立于其酶活性
在PGN染料释放实验中，当野生型AmiA_Ct与等摩尔量的活性位点突变体AmiA_Ct H67A混合孵育时，混合物的酶活性显著低于仅包含野生型AmiA_Ct的反应。这引发了AmiA_Ct是否存在独立于催化位点的PGN结合基序的疑问。生物信息学分析未发现推定的PGN结合域。通过使用纯化蛋白和枯草芽孢杆菌(B. subtilis) PGN为底物进行pull-down实验，SDS-PAGE分析显示AmiA_Ct H67A能够结合PGN。相比之下，天然AmiA_Ct部分结合到底物，也存在于上清中，表明只有天然AmiA_Ct能够释放底物。尽管AmiA_Ct序列中有一个SxN PBP基序，但将该基序中的S140突变为丙氨酸(S140A)后，该突变体在pull-down实验中仍能完全结合PGN，但在染料释放实验中却具有完全的酰胺酶活性。这些数据表明，AmiA_Ct与PGN的结合独立于其酰胺酶活性。
酰胺酶活性/AmiA_Ct可被二价阳离子螯合剂抑制
由于AmiA_Ct的体外活性已在染料释放实验中得到证实，研究人员接下来测试了能否抑制该体外反应。Pfam分类的amidase_3家族的一个共同特征是在催化中心配位一个锌原子，因此细胞分裂酰胺酶是锌依赖酶。理论上，二价阳离子螯合剂应从活性中心螯合锌原子，从而降低AmiA_Ct在染料释放实验中的活性。研究人员测试了不同螯合抗生素的作用。抗生素氯碘羟喹(clioquinol)在pH 7.5和8.5时能适度但显著地抑制反应。1,10-菲咯啉(1,10-phenanthroline)在所有测试的pH值下均能检测到抑制作用，在酸性条件(pH 5.5和6.5)下活性急剧降低。TPEN在中性和碱性pH下显示出适度但显著的抑制。为了明确抑制是否可逆，进行了包含氯碘羟喹和氯化锌且摩尔比递增的染料释放实验。当氯碘羟喹与ZnCl2的摩尔比达到1:0.25时，AmiA_Ct的酶活性得以恢复。总之，这些数据表明AmiA_Ct的体外水解活性可以被金属螯合剂以pH依赖的方式抑制。
CRISPRi介导的amiA敲低改变衣原体形态并负面影响感染性子代的产生
为了研究AmiA在衣原体细胞分裂过程中的作用，研究人员利用CRISPRi介导的敲低(KD)方法靶向amiA_Ct。构建了靶向amiA_Ct基因内区域的CRISPRi载体[pLCRia(amiA); amiA KD]并转化到沙眼衣原体中。该系统依赖于向导RNA(gRNA)的组成型表达和脱水四环素(aTc)诱导的催化失活dCas9表达。作为对照，使用携带非靶向gRNA载体的菌株[pLCRia(NT); NT]。还构建了一个互补载体，其中amiA_6xH等位基因与dCas9基因转录融合，也生成了携带该互补载体的菌株[pLCRia-amiA_6xH(amiA); amiA KDcomp]，以便在染色体拷贝被转录抑制时恢复amiA表达。
用三种菌株感染HeLa细胞，并在感染后10小时(hpi)用5 nM aTc诱导或不诱导dCas9表达。实时定量PCR(RT-qPCR)结果显示，在诱导dCas9表达后，amiA KD菌株中的amiA转录本显著减少，表明成功敲低了该靶标。在amiA KDcomp菌株中，未诱导条件下的amiA转录本水平比NT和amiA KD菌株的未诱导条件高约10倍，但诱导dCas9表达后，amiA转录本恢复到野生型水平，表明实现了成功的敲低和互补。
通过免疫荧光分析(IFA)评估amiA敲低的形态学影响，并通过测量包涵体形成单位(IFUs，感染性EBs的替代指标)来量化衣原体完成发育周期的能力。在未诱导条件下，amiA KD菌株的生物形态正常。然而，诱导amiA KD菌株后，可观察到增大的RBs，这与细胞分裂受阻的表型一致，类似于β-内酰胺处理观察到的现象。这种异常形态在测试条件下的amiA KDcomp菌株中未出现。虽然衣原体染色体拷贝数在诱导下未受显著影响，但IFU测量表明，在amiA敲低期间，IFUs有统计学意义的显著减少，而在NT或amiA KDcomp菌株中未检测到这种减少。这些数据共同表明，amiA敲低对衣原体形态有负面影响，并导致IFU产量降低。
CRISPRi介导的amiA敲低在衣原体中诱导细胞分裂抑制表型并改变PGN标记
使用“可点击”的D-丙氨酸二肽(EDA-DA)来检测衣原体PGN，同时通过对衣原体主要外膜蛋白(MOMP)进行免疫染色以可视化衣原体细胞。在感染后2小时诱导敲低，并在24小时观察效果时，发现衣原体细胞增大，并显示出细胞分裂抑制的表型。亲本和子细胞清晰可见，但表现出大小不对称，这与病原体独特分裂过程的出芽阶段暂停一致。在互补实验中，将同时过表达amiA_Ct的CRISPRi载体转化到沙眼衣原体中，诱导后，互补恢复了正常的衣原体发育。通过点击化学可视化PGN，揭示了amiA敲低对衣原体PGN的影响：PGN定位在出芽子细胞附近的离散斑块区域。互补后，具有隔膜定位的PGN环得以重建。当让这三种沙眼衣原体菌株正常生长23小时，然后诱导1小时，amiA敲低菌株比非靶向对照菌株(NT)或互补菌株表现出更高强度的PGN标记。定量分析显示，诱导敲低菌株中的PGN物体体积比未诱导菌株显著增大。标记PGN的积分密度（PGN体积与标记PGN平均强度的乘积）也得到类似结果。这些数据表明，amiA敲低导致PGN降解受损，PGN在分裂受阻的细胞出芽极积累，进而影响细胞分裂和感染性子代产生。
讨论
致病性衣原体在其独特的FtsZ非依赖性极化出芽分裂过程中合成一个短暂的PGN环。这个PGN环需要不断重塑以扩张和收缩，并且在细胞分裂后PGN被降解并回收用于未来的分裂事件。本研究表明，沙眼衣原体基因组精简后保留的唯一注释的细胞分裂酰胺酶AmiA_Ct，是一种单功能酰胺酶，能够结合和降解PGN，可以互补大肠杆菌ΔamiABC突变体，并且是衣原体细胞分裂的关键调节因子。
游离生活的大肠杆菌和胞内寄生的衣原体之间，细胞分裂酰胺酶的一个主要区别在于衣原体酰胺酶同源物明显缺乏调控机制。根据衣原体酰胺酶的计算机结构模型，酶的活性位点持续暴露，这表明一旦AmiA被输出到周质空间并接触到PGN，就会将其降解。然而，这种模式会引发出新的问题，例如AmiA是否在细胞分裂完成后被降解，并在RB细胞周期中重新合成？如何防止AmiA在衣原体分裂过程中降解正在生长的PGN环？在大肠杆菌中，细胞分裂酰胺酶通过与LytM结构域蛋白（如EnvC、NlpD）相互作用，并被FtsEX复合物激活，以确保PGN降解只在严格控制下发生。而在衣原体中，并未保留EnvC或NlpD的同源物，也不编码FtsEX同源物来启动激活级联反应。因此，衣原体AmiA的调控机制仍然是个谜。
尽管衣原体酰胺酶的底物识别和结合模式仍有待完全阐明，但酶活性中心配位的锌在该酶类中是保守的，很可能扮演重要角色。利用螯合二价阳离子的化合物进行的实验表明，AmiA_Ct的体外活性可以被氯碘羟喹、1,10-菲咯啉和TPEN以pH依赖的方式抑制，其中1,10-菲咯啉在酸性pH下效果最强。通过添加过量锌可以逆转氯碘羟喹的抑制，凸显了抑制可能是由锌螯合引起的。
除了一个推定的具有裂解性转糖基酶活性的SpoIID同源物（如在衣原体相关细菌沃德菌中所示）外，AmiA是迄今为止在衣原体物种中发现的唯一已知的PGN降解酶。利用CRISPRi敲低技术，研究人员研究了amiA_Ct基因敲低的效应。结果显示，在amiA敲低条件下，细胞表现出与抑制细胞分裂相似的表型。敲低也影响了PGN，使其在具有细胞分裂抑制表型的细胞的出芽极积累。通过用额外的质粒编码的amiA等位基因互补敲低，可以恢复正常的细胞形态和PGN定位，证实观察到的效应是由amiA敲低引起的。在amiA敲低时，衣原体的PGN降解可能严重受损，而PGN生物合成仍然具有功能，这将导致PGN积累。增加的PGN标记强度被认为是高水平的PGN合成超过分解代谢过程的结果。由于衣原体在amiA敲低条件下无法在其细胞周期中降解PGN环，这将导致细胞分裂受阻，并伴随感染性EBs产量的减少，正如实验所证明的。有趣的是，观察结果还表明，沙眼衣原体中AmiA依赖的PGN更新不仅在隔膜形成中很重要，而且在衣原体分裂过程的出芽阶段发生的PGN环扩张中也起着重要作用。
总体而言，本研究数据突出了AmiA酰胺酶在衣原体细胞分裂及衣原体生长中的关键作用。需要进一步的工作来理解AmiA在衣原体中的功能是如何被调控的，以及分裂过程中PGN合成与降解之间的相互作用。
