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这篇综述系统梳理了机会致病菌铜绿假单胞菌在适应环境温度变化(如从室温到37°C体温)过程中的复杂调控网络。文章深入探讨了其温度调节的全局、转录、转录后及翻译后水平的已知机制，并指出了该领域的研究空白与未来方向，为理解其环境适应性与致病力提供了关键洞见。
铜绿假单胞菌：一个重要的机会性和医院获得性病原体
铜绿假单胞菌是一种高度适应性的革兰阴性机会致病菌和医院获得性病原体。尽管它能在土壤或水等自然环境中存活，但最常从医院水槽、物体表面等人类相关环境中分离出来。它对许多抗生素具有天然耐药性，且多药耐药菌株，特别是对碳青霉烯类耐药的菌株，被美国疾病控制与预防中心列为严重的公共卫生威胁。铜绿假单胞菌是囊性纤维化患者急性和慢性呼吸道感染的主要原因，也可导致医院获得性感染，如呼吸机相关性肺炎、导管相关性尿路感染、烧伤/伤口感染、菌血症以及角膜感染。
虽然铜绿假单胞菌能在4°C到42°C的广泛温度范围内生存和生长，但实验室研究通常在37°C下进行，以模拟人体温度并促进其最佳生长速率。作为机会致病菌，它在感染循环中不可避免地需要在环境温度(20°C–25°C)和人体温度(37°C)之间转换，这要求其必须适应不同的温度。
细菌如何感知温度？
与许多细菌一样，铜绿假单胞菌进化出了感知环境几乎所有方面并相应调整细胞过程以维持稳态的系统。然而，尚未发现能感知温度变化的特定分子。由于温度可以通过生物物理变化直接影响细菌生理的几乎所有方面，温度适应的研究范围很广，涵盖多种不同类型的温度调节。例如，细胞可以通过膜流动性的变化来感知温度变化。通常，细菌膜在温度升高时流动性增加，温度降低时流动性降低。由寒冷条件引起的流动性降低已被证明可以改变膜激酶的结构，使其活性形式增加，从而导致反应调节因子的磷酸化，从而上调增加膜脂中不饱和脂肪酸含量的基因。
基因表达可以被温度调节，这可能是由于多种机制。转录激活因子和抑制因子可能由于其自身的转录温度调节或热（不）稳定性而存在或缺失，从而以温度依赖性方式改变下游基因表达。调节因子也可能仅因在特定温度下发生的构象变化而具有功能，从而导致其靶基因的温度依赖性调节。DNA的局部结构以及质粒DNA的超螺旋也可以受温度变化影响，并调节启动子对转录调节因子和RNA聚合酶的可及性。RNA的二级结构对温度敏感，可以采取有利于或阻碍翻译的不同形式。RNA转录本也可以在温度依赖性方式下优先降解，最终影响翻译。最后，蛋白质的结构、稳定性或活性都可能依赖于温度，这可以导致蛋白质下游效应的温度调节。很可能存在比目前已确定的更多的温度调节机制。
转录组学和蛋白质组学的进步通过促进在不同温度下生长的铜绿假单胞菌的无偏筛选，对温度调节的研究做出了重大贡献。组学技术研究温度调节的一个主要优点是，可以在两个或更多温度下比较细胞中RNA或蛋白质的水平，而无需选择性压力，以识别必需和非必需的温度调节基因和蛋白质。
温度调节的组学研究
室温与37°C下的转录组学
三项转录组学研究描述了与铜绿假单胞菌作为在人为环境中存活的机会致病菌相关的两种温度下的全局基因表达。早期研究发现，在25°C下，许多与基本细胞功能（如代谢和蛋白质分泌）相关的基因上调。对分泌蛋白的分析发现，分泌的外蛋白酶PIV（蛋白酶IV）和VI型分泌系统效应子Hcp在25°C时水平更高。另一项RNA-seq研究发现，III型分泌系统基因和吩嗪生物合成基因在37°C时显著富集，而蛋白质合成基因在28°C时上调。一项微阵列研究也发现，蛋白质合成基因在22°C时上调，而大多数分泌因子和毒力因子在37°C时上调（PIV除外）。这些研究均在稳定期进行，发现了数百个温度调节基因，基因身份的差异可能源于使用的菌株不同。另一项对根际菌株M18的转录组分析发现，与哺乳动物毒力相关的基因（如III型分泌系统、分泌蛋白酶和吩嗪生物合成）在37°C时表达更高，而与根际生存相关的基因（如铜抗性基因和芳香族化合物代谢基因）在更接近根际温度的28°C时上调。
37°C与热激下的转录组学
除了从环境转移到人类宿主相关的温度变化外，铜绿假单胞菌还可能经历从平均人体温度37°C到模拟发烧的升高温度的变化。一项转录组学研究检查了在37°C与46°C（更接近实验性热激条件）下生长的PAO1。在46°C时，133个基因的表达出现差异调节，其中众所周知的细菌热激基因clpB、dnaK、dnaJ、groEL、grpE和asrA高度上调。一个有趣的发现是热激上调了rsmA，这是一个复杂的转录后调节因子，控制着许多表型，包括从急性感染到慢性感染的转变。研究还注意到许多基因在46°C时下调，包括与IV型菌毛和VI型分泌系统相关的基因。
37°C与发热温度下的转录组学
另一项转录组学研究探讨了PAO1和金黄色葡萄球菌USA300在39°C（生理相关的发热温度）下共培养与单培养时的反应。在单培养时，与37°C相比，在39°C下生长引起的PAO1转录变化相对较少；当与USA300共培养时，与37°C相比，在39°C下生长引起了PAO1代谢途径、运动基因和III型分泌系统表达的变化。这项工作展示了温度和群落组成等多种环境因素如何相互作用以改变细菌生理。
转录组学和蛋白质组学研究为未来的机制研究确定了许多温度调节的基因和蛋白质，但在许多情况下，这些研究关于温度调节机制产生了比答案更多的问题。
转录温度调节
基因表达可以因启动子活性的差异而被温度调节，这可能是由温度敏感的转录调节因子和/或σ因子引起的。转录温度调节通常是蛋白质水平差异的机制基础，因为在一个温度下转录增加会导致该基因产物的翻译增加，是细菌快速适应压力环境（如热激）的常见机制。
热激反应调节
对铜绿假单胞菌热激的早期研究发现了17种在温度从30°C转移到45°C后诱导的蛋白质。使用已知大肠杆菌热激蛋白的抗体鉴定了铜绿假单胞菌中同源的热激上调蛋白，如DnaK和GroEL。随后，rpoH基因被鉴定和测序。研究发现，在热激条件下，algU（编码σ因子AlgU，也称为AlgT或RpoE/σ24）从特定的启动子上调，进而上调自身和rpoH，而rpoH又上调一系列热激反应基因，包括dnaK和groEL。对粘液转化调节的研究也促进了理解，因为AlgU被发现与大肠杆菌的σE高度相似且可互换。AlgU在热激温度下从自身的第一和第三启动子增加表达，导致AlgU蛋白水平增加以及AlgU调节的algR基因表达增加。AlgU随后被发现从热激诱导的rpoH P3启动子指导rpoH的转录。最近，通过结合RNA-seq和ChIP-seq，确定了铜绿假单胞菌的主要RpoH调节子，鉴定出许多蛋白酶和蛋白质伴侣。
虽然热激的转录温度调节可能是铜绿假单胞菌中研究最广泛的温度调节机制，但关于温度如何转导以调节基因表达，仍有最多的未解问题。例如，目前尚不清楚温度如何从一开始就诱导algU从热激启动子转录以启动热激级联反应，以及AlgU如何从这些相同的启动子调节自身作为其温度调节的一部分。一种可能性是存在一个由热激激活的额外转录因子，促进algU从热激启动子表达。另一种可能性是DNA温度计，这在细菌中相对于其他形式的温度调节研究较少，尤其是在铜绿假单胞菌中。
显示转录温度调节的特定基因
得益于RNA-seq的进步，更多关于温度如何影响铜绿假单胞菌全局转录组的无偏研究有助于识别基因表达被温度调节的基因，特别是在低于37°C的温度下。其中一个基因piv在测试的室温（22°C或28°C）下与37°C相比持续上调。研究发现piv在转录水平被温度调节，并且群体感应调节因子LasR在25°C时对piv的上调程度远高于37°C。另一个在室温下上调的毒力因子是甲基转移酶EftM，eftM在25°C时比37°C表达更高，这是由于在25°C时启动子活性增加。早期RNA-seq研究将cmaX鉴定为热激诱导基因。cmaX是cmaX-crfX-cmpX操纵子的第一个基因。尽管cmaX-crfX-cmpX在帮助细胞适应不同热胁迫中的功能尚不清楚，但后续对该操纵子复杂转录温度调节的研究初步揭示了膜流动性如何感知和响应温度变化，特别是冷激。另一个预测参与膜适应温度变化的温度调节基因是htrB1，这是一种参与脂质A生物合成的2-OH-月桂酰转移酶。作者发现htrB1在21°C时与37°C相比上调，因此与37°C相比，在21°C时对抑制细胞壁的碳青霉烯类的抗性更重要。
尽管尚不清楚细胞如何检测由不同类型胁迫引起的膜流动性变化，但已知膜流动性胁迫会改变基因表达和细胞生理。膜流动性持续降低的突变体显示严格反应调节因子RelA的表达增加，导致警报分子(p)ppGpp水平增加，并引起群体感应的过早激活。万古霉素可以降低膜流动性并诱导铜绿假单胞菌中sigX的表达，冷激也是如此。这些发现暗示，一种未知的跨膜蛋白可能因膜流动性降低而发生结构和/或功能改变，从而导致像SigX这样的调节因子被激活，进而控制基因表达以增加膜流动性并适应胁迫环境。
多个菌株的生物膜产生、结构和组织也已被证明在转录温度调节水平上受温度影响。一项研究检查了PAO1和PA14在20°C、25°C、30°C和37°C下的生物膜形成，发现生物膜形成在20°C时最高，其次是37°C、30°C，在25°C时最低。在20°C下形成的生物膜也最厚，并形成了在较高温度下不存在的独特的蘑菇状结构。作者发现细胞内环二鸟苷酸的水平在20°C时达到峰值，PAO1和PA14中重要的胞外多糖（EPS）藻酸盐、Pel和Psl的生物合成基因的转录也是如此。生物膜形成、c-di-GMP水平和EPS基因表达的确切温度调节模式在25°C、30°C和37°C时在PAO1和PA14之间有所不同，表明菌株特异性差异存在于温度感知以调节生物膜形成的方式中。有趣的是，已发现一株临床分离的铜绿假单胞菌在37°C时由于c-di-GMP合成增加而导致生物膜形成增加，这凸显了铜绿假单胞菌菌株之间生物膜形成和调节的差异。另一项仅针对PA14的研究发现，丝状前噬菌体Pf1的表达在37°C时高于23°C，而主要Pf1衣壳蛋白基因coaB的缺失仅在37°C时导致生物膜质量减少，在23°C时无影响。由于这种丝状前噬菌体（在PAO1中称为Pf4）也通过调节先天免疫和促进感染期间生物膜扩散而与疾病严重程度表型相关，其在37°C时的转录上调表明这种温度调节是哺乳动物感染的适应机制。
转录温度调节的机制基础难以研究；与响应特定环境或营养信号的调节因子不同，目前尚未识别出温度调节转录因子结合的一个特定共有序列，这阻碍了生物信息学研究。
转录后温度调节
细菌快速响应温度变化的另一种机制是RNA温度计，这是一种控制转录本翻译的二级结构。通常，RNAT位于mRNA的5′非翻译区，其功能是在非允许温度下形成二级结构以封闭核糖体结合位点，而在允许温度下采用RBS可及的结构。大多数研究针对在温暖温度下“打开”以促进与哺乳动物感染相关的毒力因子翻译的RNAT。这导致了基于封闭RBS的二级结构特征将“拉链样”RNAT分为三类：ROSE家族、fourU家族和未分类家族。拉链样RNAT随着温度升高逐渐“熔化”或向开放构象移动。与拉链样RNAT相比，开关RNAT根据温度采用两种不同的二级结构，一种“开放”一种“关闭”翻译。这些已在冷激基因的5′ UTR中发现。
ROSE和ROSE样RNAT
在室温与人体温度下对铜绿假单胞菌的转录组学研究表明，许多群体感应调节基因在37°C时上调。在rhlA的5′ UTR中发现了一个具有ROSE元件的RNAT，并发现当rhlR在多顺反子rhlAB-R转录本中表达时，该RNAT温度调节RhlR蛋白水平。rhlA RNAT长度超过100 bp，结构预测显示多个大环，包括靠近UTR 3′端的包含RBS的发夹。有趣的是，抗RBS序列偏离了ROSE温度计的典型U(U/C)GCU序列，但确实保留了RBS对面重要的未配对G。作者发现，在37°C时改善rhlAB-R转录本的翻译增加了转录通读，最终增加了37°C时的RhlR蛋白水平。这种RNAT对RhlR水平的独特效应有助于在37°C时增加RhlR调节的毒力因子水平，包括鼠李糖脂本身以及绿脓菌素。
在lasI的5′ UTR中发现了一个具有ROSE某些特征的RNAT；RBS的一半被发夹封闭，另一半暴露在单链环中，且发夹缺乏RBS对面的特征性未配对G。基于这些特征，该RNAT被认为是ROSE样。尽管这种结构确实有助于lasI的温度调节，但对LasRI调节基因（除了rhlRI）的影响很小。另一个ROSE样RNAT在热激蛋白ibpA的5′ UTR中被生物信息学预测到，并且温度如何改变二级结构以调节核糖体可及性的机制得到了很好的表征。这个短的61 bp RNAT有两个环，第二个环被证明包含一个发夹，以ROSE典型的抗RBS序列U(U/C)GCU和中央未配对G封闭RBS。RNAT通过在25°C时阻断核糖体访问但在42°C时允许其访问来发挥翻译控制作用。
未分类RNAT
由于缺乏保守序列，系统地识别RNAT是困难的。一项巧妙的前向遗传筛选确定了四个基因候选者，其转录后温度调节的“开启”状态在37°C。ptxS和PA5194（一种推测的膜蛋白）的5′ UTR被验证为在铜绿假单胞菌从28°C过渡到42°C时控制转录后温度调节。预测的二级结构不像ROSE或fourU元件；ptxS RNAT包含两个茎环，而PA5194是具有四个环的更复杂结构。RNase降解和突变分析表明，包含翻译起始区域的ptxS RNAT的第二个环在42°C时打开。PA5194 RNAT的第二个发夹内同时含有RBS和AUG起始密码子；一半的RBS预测与类似fourU RNAT的UUU抗RBS碱基配对。对此三U抗RBS的突变并未完全消除热响应，而是调节了整体翻译水平，表明该RNAT可能通过调节RBS和起始密码子在温度响应中的可及性来发挥作用。据我们所知，在铜绿假单胞菌中尚未发现典型的fourU RNAT，尽管PA5194 RNAT不完全符合所有fourU特征，但我们注意到它具有fourU样元件。
识别和研究RNAT可能很困难。利用结构建模预测RNA结构在温度响应中的进展有助于识别新的RNAT，但在识别不符合ROSE或fourU元件和/或严重依赖非沃森-克里克碱基配对的新型RNAT方面仍然有限。像SHAPE-MaP这样的技术，理论上可以应用于无偏地确定特定细菌中所有具有温度敏感结构的RNA。
与其他形式的温度调节一样，通常有更多关于RNAT在较暖温度下“打开”的研究，尤其是在铜绿假单胞菌中。然而，术语RNAT有时仅指其允许状态随着温度升高而实现的热温度计，尽管已知一些热温度计的允许状态在低温下或随着温度降低而有利于翻译控制。我们鼓励将术语RNAT拓宽为具有温度敏感二级结构的RNA，并进一步细分RNAT类别，以其转导温度的机制和允许状态的温度为特征。因为冷激温度计随着温度降低而变得可翻译，它们的作用机制通常与热激温度计不同，对它们的更多研究可以识别新型温度计以及与热激或毒力无关的基因中的温度计，而对这些基因知之甚少。
翻译后温度调节
酶的活性通常受温度影响，除此之外，蛋白质的结构、稳定性和翻译后修饰都可能受温度影响，最终温度调节蛋白质活性。与其他温度调节机制一样，识别翻译后温度调节的蛋白质通常涉及针对特定表型的费力筛选、大型蛋白质组学研究或偶然发现。
热敏感蛋白结构
对热调节甲基转移酶EftM的发现始于识别延伸因子Tu上被ChoP抗体识别的表位，该表位出现在细菌细胞表面，并且在22°C时比37°C时更多。对PA14转座子库筛选在任何温度下EF-Tu缺乏这种PTM的突变体，导致了eftM的鉴定。质谱和生化分析显示，ChoP样表位实际上是EftM在EF-Tu的赖氨酸残基5上添加三个甲基基团，这种三甲基化模拟了ChoP和PAF的结构，与气道上皮细胞上的PAF受体相互作用并促进附着。有趣的是，这种三甲基化不影响EF-Tu作为翻译期间将氨酰化tRNA携带到核糖体复合物的经典功能。EftM的三甲基化活性在体内25°C时发生，但在37°C时不发生，并且在体外37°C孵育纯化的EftM蛋白显著降低了酶活性，因为EftM的结构高度不耐热，不可逆的展开发生在30°C及更高温度。
热敏感蛋白活性
在慢性CF分离株CF39S中鉴定的热敏感二鸟苷酸环化酶TdcA的活性被发现是温度调节的。作者发现，随着温度升高，CF39S产生的生物膜显著增多，在34°C及以上达到最大生物量，这是由于TdcA产生越来越多的c-di-GMP。TdcA在铜绿假单胞菌的实验室菌株中不存在，但存在于临床菌株中，位于一个类似Tn7的转座子内，该转座子类似于首次在大肠杆菌中发现的水平获得的热抗性基因座。TdcA预测包含一个N端的PAS传感结构域，通过一个α螺旋连接子连接到一个特征明确的GGDEF c-di-GMP催化结构域。广泛表征表明，PAS结构域感知温度，并可能通过PAS结构变化调节GGDEF结构域的催化活性，该变化通过α螺旋连接子转导。温度调节的c-di-GMP水平不仅影响生物膜的产生，还影响铜绿假单胞菌在环境温度与人体温度下的毒力。
热敏感甲基转移酶EftM和二鸟苷酸环化酶TdcA在热信号如何实际转导以调节蛋白质活性以及这些蛋白质的温度调节在铜绿假单胞菌感染不同阶段可能发挥的作用方面得到了相当好的表征。有趣的是，EftM产生的修饰在所研究的一系列遗传上无关的临床菌株中是保守的，而TdcA在铜绿假单胞菌基因组数据库中可用的铜绿假单胞菌序列中不到1%。TdcA的获得可能使
