《Renal Failure》：Transcriptome and weighted gene co-expression network analysis identify hub genes and pathways in rat kidneys after deep hypothermic circulatory arrest
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本文首次利用大鼠深低温停循环（DHCA）模型，通过整合高通量转录组测序、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络分析，系统性鉴定了DHCA相关急性肾损伤（DHCA-AKI）中的10个核心枢纽基因（Jun, Atf3, Cebpb, Il-1β, Nfκbia, Ptgs2, Cxcl1, Nfκbiz, Zfp36, Tnfaip3）。研究发现这些基因主要富集于炎症与凋亡相关通路，揭示了DHCA-AKI的潜在分子机制，为发现新的治疗靶点提供了重要线索。
引言
深低温停循环（DHCA）是一种主要用于主动脉夹层手术的体外循环（CPB）技术。尽管低温降低了器官代谢，但循环停止及后续再灌注带来的损伤，尤其是急性肾损伤（AKI），仍是术后常见且严重的并发症，死亡率高且缺乏有效药物治疗。本研究旨在通过建立大鼠DHCA模型，利用转录组学与生物信息学方法，阐明DHCA-AKI的关键分子机制。
材料与方法
研究建立了大鼠DHCA模型，手术对照组进行假手术。在CPB停机后1小时收集肾脏组织进行高通量转录组测序。通过三种独立方法（DESeq2, limma, edgeR）鉴定差异表达基因（DEGs）。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与DHCA相关的基因共表达模块。将DEGs与关键模块基因取交集，得到候选枢纽基因，并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。基于STRING数据库构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，并使用Cytoscape的CytoHubba插件筛选前10个枢纽基因。利用iRegulon插件预测上游转录调控因子。此外，还将DHCA-AKI的DEGs与肾缺血再灌注损伤（IRI-AKI）和脓毒症相关AKI（SA-AKI）模型的公开数据进行了比较。通过测定血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）评估肾功能。采用实时定量PCR（RT-PCR）、免疫组化（IHC）和蛋白质印迹（Western blot）在组织和蛋白水平验证枢纽基因表达。在体外，使用人肾小管上皮细胞（HK-2）模拟DHCA条件（缺氧、低温、复氧），通过免疫荧光（IF）和RT-PCR进一步验证枢纽基因的变化。
结果
模型构建与差异表达基因鉴定
成功建立大鼠DHCA模型。转录组测序分析共鉴定出115个稳健的DEGs（77个上调，38个下调）。
共表达网络与功能模块分析
WGCNA分析识别出9个基因共表达模块，其中棕色模块与DHCA-AKI呈极显著正相关（相关系数=0.98，p<0.001），包含209个核心基因。将该模块基因与DEGs取交集，得到86个候选枢纽基因。
候选枢纽基因的功能富集
GO富集分析显示，这些基因主要参与对脂多糖/细菌分子的反应、炎症调节、p38 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联等生物过程，以及DNA结合转录因子活性等分子功能。KEGG通路分析表明，这些基因显著富集于MAPK、IL-17、NFκB（核因子κB）、TNF（肿瘤坏死因子）、p53、FoxO（叉头框蛋白O）、细胞凋亡、NOD样受体和C型凝集素受体等信号通路。
枢纽基因的筛选与上游调控分析
通过PPI网络分析，确定了前10个枢纽基因：Jun, Atf3, Cebpb, Il-1β, Nfκbia, Ptgs2, Cxcl1, Nfκbiz, Zfp36, 和 Tnfaip3。这些基因在DHCA组肾脏中的mRNA（信使核糖核酸）水平均显著上调。上游调控分析预测RELA（即p65，NFκB亚基）和ATF3是调控这些枢纽基因的关键转录因子。
与其他类型AKI的分子特征比较
与IRI-AKI和SA-AKI模型的比较显示，DHCA-AKI具有独特的转录特征，共享基因很少，提示其具有特异的病理生理过程。
肾功能与枢纽基因的实验验证
DHCA组大鼠血清Cr、BUN和NGAL水平显著升高，表明肾功能严重受损。RT-PCR证实所有10个枢纽基因在DHCA肾脏中的mRNA表达均显著上调。组织病理学检查（H&E和PAS染色）显示DHCA组肾脏存在明显的细胞变性、炎症细胞浸润、刷状缘丢失等损伤。免疫组化染色进一步显示，所有10个枢纽基因的蛋白在DHCA组肾脏中均呈现强阳性表达，而对照组表达微弱或阴性。蛋白质印迹分析验证了JUN、ATF3、IL-1β、CXCL1、NFκBIZ和TNFAIP3蛋白水平在DHCA组显著升高。
体外细胞实验验证
在HK-2细胞中模拟DHCA条件后，免疫荧光和RT-PCR均显示所有10个枢纽基因在mRNA和蛋白水平显著上调，与体内结果一致。
讨论
本研究首次系统描绘了大鼠DHCA后肾脏的转录组变化图谱，并鉴定出10个核心枢纽基因。这些基因主要与炎症和凋亡通路相关，在DHCA-AKI的发病机制中可能起中心作用。其中，Jun（AP-1转录因子）可能促进炎症和细胞毒性反应；Atf3作为应激诱导基因，可能发挥双重作用；Cebpb、Ptgs2和Cxcl1可能分别通过驱动炎症、合成前列腺素和趋化中性粒细胞加剧肾损伤；Nfκbia和Nfκbiz作为NFκB通路抑制因子，其上调可能是一种限制炎症的反馈机制；Zfp36和Tnfaip3则可能通过其抗炎和抗凋亡功能发挥保护作用。研究揭示的NFκB、TNF、MAPK、IL-17、p53、FoxO和细胞凋亡等关键通路，构成了DHCA-AKI复杂的分子网络。这些枢纽基因和通路不仅阐明了DHCA-AKI的潜在机制，也为其早期诊断和靶向治疗提供了新的方向。
局限性
本研究的RNA测序样本量较小，但通过增加测序深度和多角度验证增强了可靠性。CPB预充液中使用了羟乙基淀粉（HES），其潜在肾脏影响仍有争议。研究未评估肾小球功能（如尿蛋白），也未采集纵向样本。
结论
DHCA显著改变了大鼠肾脏的转录组景观。与炎症和凋亡相关的枢纽基因及通路是DHCA-AKI发病机制的核心环节，可能作为有前景的治疗靶点。
