基于N-氨基邻苯二甲酰亚胺的不饱和聚碳酸酯（PC）反应辅助分析方法，利用超高性能液相色谱-电喷雾离子化质谱/质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）技术来确定脂肪酸链中碳-碳双键的位置以及顺式/反式异构体的构型

磷脂酰胆碱（PCs）双键位置和顺反异构体分析存在技术瓶颈，本研究创新性地采用N-氨基苯甲酰亚胺（PhthNH2）衍生化结合UHPLC-ESI-MS/MS技术，通过特异性形成N-丙二烯基加合物实现双键位置精确定位，并成功分离单不饱和PCs的顺反异构体。方法在血浆样本中鉴定出31种双键位置异构体，为脂质组学研究提供新工具。

　　

岳春林|赵玲玉|杨金琪|曹圆|舒珊|张洋洋|赵振文

中国科学院北京国家分子科学实验室，北京分子科学卓越研究中心/教育中心，北京质谱中心，化学研究所，北京100190，中国

摘要

背景

磷脂酰胆碱（PCs）是生物膜的关键组成部分，在许多生理过程中发挥着重要作用。其中，脂肪酸酰基链中碳-碳双键（C=C）的位置及顺反异构性对生理功能和疾病机制具有关键影响。传统的液相色谱-质谱（LC-MS）技术无法同时分辨磷脂酰胆碱的位点和顺反异构体。

结果

为了解决传统LC-MS/MS技术在区分磷脂酰胆碱异构体方面的局限性，我们开发了一种新的方法，该方法结合了N-氨基邻苯二甲酰亚胺（PhthNH₂）衍生化技术与超高效液相色谱-电喷雾离子化质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）。该方法利用PhthNH₂与C=C键之间的特异性反应生成N-氮杂环丙烷加合物，通过特征碎片离子实现双键位置的精确定位，并在单不饱和磷脂酰胆碱中实现顺反异构体的基线色谱分离。

意义

我们成功建立并优化了一种衍生化工作流程和数据分析程序，能够同时检测磷脂酰胆碱中C=C键的位置及顺反异构体。该方法在血浆样本中成功鉴定了31种C=C位点异构体，并发现结直肠癌患者与健康对照组之间磷脂酰胆碱异构体的丰度存在显著差异，为研究磷脂酰胆碱的生物学特性及其与疾病的关系提供了强大的新工具。

引言

磷脂酰胆碱（PCs）是生物膜的主要成分，在细胞信号传导、膜流动性调节和能量储存等关键生理过程中发挥着重要作用1, 2, 3。研究表明，磷脂酰胆碱的组成和结构变化与多种疾病的发展密切相关，包括心血管疾病、代谢综合征、癌症和神经退行性疾病4, 5, 6, 7。深入理解磷脂酰胆碱的结构特征，特别是不饱和脂肪酸酰基链中碳-碳双键（C=C键）的位置及顺反异构性，对于阐明其生物学功能、疾病机制以及开发新的诊断和治疗方法至关重要8, 9。

磷脂酰胆碱的结构多样性体现在多个层面：（1）脂肪酸酰基链的组成，包括链长和C=C键的数量；（2）sn-位点异构体，即脂肪酸酰基链在甘油骨架的不同位置发生酯化¹⁰；（3）C=C键的位置及顺反异构性，这对不饱和磷脂酰胆碱尤为重要¹¹。传统的液相色谱与质谱（LC-MS/MS）技术在分辨C=C键的位置和几何异构体方面能力有限12, 13。一些研究采用了衍生化策略，如环氧化、臭氧化和Paterno-Büchi反应，以增强基于质谱的C=C键位置检测14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21。然而，这些方法通常需要复杂的样品预处理（例如避光、脱氧、加热）或仪器改造（例如在特定波长下照射）。此外，所得衍生物仅能帮助确定C=C键的位置，无法辅助分析C=C键的构型，从而限制了它们的广泛应用。

鉴于现有的C=C键衍生化策略，不同杂环化合物生成的特征碎片各不相同。烯烃经臭氧化后生成的五元杂环（臭氧化物）极不稳定，容易发生水解或醇解，产生醛、酮或α-氧过氧化物，导致产物种类繁多（图S1（a））。四元环衍生物具有一对位点异构体（例如氧杂环丁烷）。尽管两个母离子的质荷比（m/z）相同，但四个C=C键位点特征片段的m/z不同。因此，一个C=C键在衍生化后会产生四个不同的碎片离子，增加了多不饱和脂质结构分析的数据量（图S1（b）。三元环衍生物只有顺反异构体（碳链位于三元环的同侧或相反侧），因此位点异构体与碎片离子之间的对应关系更为明确。一个C=C键在衍生化后仅产生两个特征碎片离子（图S1（c）。因此，三元环衍生物的谱图分析在脂质组学研究中更为便捷，有利于大规模脂质组学研究。基于液相色谱-质谱（LC-MS）和将C=C键转化为三元环的化学反应来检测C=C键的顺反异构体是一种潜在的有效分离和分析策略。

在本研究中，我们开发了一种新的N-氨基邻苯二甲酰亚胺（PhthNH₂）衍生化方法，结合超高效液相色谱-电喷雾离子化质谱（UHPLC-ESI-MS）技术，用于分析磷脂酰胆碱中C=C键的位置和顺反异构体。PhthNH₂已被报道为一种高效的衍生化试剂，可特异性地与脂肪酸中的C=C键反应生成N-氮杂环丙烷加合物²²。在本研究中，我们将PhthNH₂衍生化方法从脂肪酸（单一组分脂质）扩展到结构更复杂的磷脂酰胆碱。更重要的是，我们发现磷脂酰胆碱衍生物的钠加合物（而非脂肪酸衍生物的质子加合物）在碎片化过程中能生成具有更高特异性和更好信噪比的C=C键定位特征碎片离子。此外，还实现了磷脂酰胆碱顺反异构体的基线色谱分离。最终，通过优化色谱条件和质谱参数，我们建立了一种稳健的磷脂酰胆碱异构体分析工作流程，并成功应用于血浆样本分析。在实际样本分析中，我们鉴定了31种磷脂酰胆碱的C=C位点异构体，包括PC 34:1、PC 34:2、PC 36:1、PC 36:2、PC 36:3和PC 38:4，为脂质组学研究提供了大量数据支持。

方法片段

化学物质和试剂

脂质标准品PC 16:0/18:1 (9Z)和PC 18:1(9Z)/16:0购自InnoChem（北京，中国），而PC 16:0/18:1 (9E)、PC 16:0/18:1 (11Z)和PC 16:0/20:3 (8Z, 11Z, 14Z)购自Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴斯特，AL）。脂质命名遵循LIPID MAPS标准。对于磷脂，sn（立体特异性编号）系统指定了脂肪酸酰基在甘油骨架上的位置。例如：PC 16:0/18:1表示甘油骨架上FA 16:0位于sn-1位置

氮杂环丙烷化反应的方法

以PC 16:0/18:1 (9Z)作为模型脂质，我们获得了优化的反应条件（室温下反应10分钟，见图S2），所有后续实验均在这些条件下进行。进一步通过电喷雾离子化质谱（ESI-MS）分析发现，磷脂酰胆碱衍生物主要以[M+H]⁺和[M+Na]⁺加合物离子的形式存在，未观察到副产物（图1a）。无论磷脂酰胆碱的种类如何，反应均能高效进行

结论

本研究开发了一种基于N-氨基邻苯二甲酰亚胺的衍生化方法，结合超高效液相色谱-电喷雾离子化质谱（UHPLC-ESI-MS），用于分析磷脂酰胆碱中C=C键的位置和顺反异构体。该方法通过高信噪比的特征碎片离子实现了C=C键位置的准确测定，并在单不饱和磷脂酰胆碱中实现了顺反异构体的基线分离。我们在血浆样本中成功鉴定了31种C=C位点异构体，证明了该方法的可靠性和适用性

CRediT作者贡献声明

舒珊：正式数据分析、数据管理。张洋洋：正式数据分析、数据管理。赵振文：项目管理、方法学研究、资金申请、数据管理。岳春林：方法学研究、实验设计、概念构思。赵玲玉：验证工作、项目管理。杨金琪：数据管理、概念构思。曹圆：方法学研究、实验设计

未引用的参考文献

23.; 24.; 25..

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（编号：2018YFA0800900）的支持。