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本文研究了FATP2（脂肪酸转运蛋白亚型2）特异性抑制剂lipofermata的抗寨卡病毒（ZIKV）活性。研究证实，lipofermata可有效抑制寨卡病毒在永生化肝细胞（imHC）和神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞系中的复制，其半数抑制浓度（IC50）分别为1.41和1.11 μM，且细胞毒性低（CC50> 20 μM）。机制上，寨卡病毒感染会上调SH-SY5Y细胞中FATP2的mRNA和蛋白表达，并增加细胞磷脂酰胆碱（PC）水平。Lipofermata能以7.0 μM的IC50抑制脂肪酸摄取，并显著降低PC含量。此外，通过siRNA敲低FATP2也能减少病毒滴度。研究还发现，lipofermata可显著降低病毒诱导的caspase 3/7和8活性，缓解细胞凋亡。这些结果表明，靶向FATP2抑制脂肪酸摄取是抗寨卡病毒治疗的一个有前景的新策略。
摘要
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染在成人中通常轻微且具有自限性，但在孕期感染可导致胎儿和新生儿小头畸形。目前尚无获批的药物或疫苗。寨卡病毒劫持宿主脂质稳态以促进自身复制，而脂肪酸合成抑制剂已被证明可减少病毒产量。然而，细胞通过新生合成和摄取两条途径获取脂质。作为寨卡病毒致病的主要靶点，神经元的新生脂质合成能力有限，更依赖于脂质摄取。本研究探讨了脂肪酸转运蛋白亚型2（Fatty acid transporter protein isoform 2, FATP2）特异性抑制剂lipofermata的抗寨卡病毒及抑制脂肪酸摄取活性。
引言
寨卡病毒是黄病毒科的一种正链单股RNA病毒，通过蚊媒传播。尽管成人感染通常症状轻微，但它与胎儿小头畸形和格林-巴利综合征相关，对公共卫生构成严重威胁。病毒复制高度依赖宿主脂质，利用脂滴并诱导脂质谱重编程，特别是增加磷脂如磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE），以构建源自内质网（ER）的病毒复制复合体（RC）。虽然抑制脂肪酸合成的降脂药物（如他汀类）已显示出抗寨卡病毒活性，但脂肪酸摄取在病毒复制中的作用尚未明确。细胞通过被动扩散、脂肪酸转位酶（CD36）、脂肪酸转运蛋白（FATP）等多种途径摄取脂肪酸。其中，FATP2因其在肠道、肝脏、肾脏等组织中的重要作用，并存在于大脑和胎盘中，成为一个有潜力的治疗靶点。Lipofermata是一种正在开发中的特异性FATP2抑制剂。本研究旨在探究lipofermata在永生化肝细胞（imHC）和人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中的抗寨卡病毒效果及其机制。
材料与方法
研究使用了永生化肝细胞（imHC）和人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y），以及从泰国患者临床分离的寨卡病毒毒株（MU-DMSC-4/2017）。通过细胞活力实验测定lipofermata的半数细胞毒性浓度（CC50）。在病毒感染后加入不同浓度lipofermata，通过焦点免疫测定法检测病毒滴度，计算其半数抑制浓度（IC50）。利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测病毒感染后SH-SY5Y细胞中FATP2的mRNA和蛋白表达水平。采用荧光标记的棕榈酸（BODIPY FL C16）摄取实验评估lipofermata对脂肪酸摄取的抑制能力（IC50）。通过薄层色谱法（TLC）分析细胞脂质，特别是PC和PE的含量变化。使用多重caspase活性检测试剂盒测量lipofermata对寨卡病毒诱导的细胞凋亡（caspase 3/7, 8, 9活性）的影响。最后，通过siRNA转染敲低SH-SY5Y细胞中的FATP2，验证其对病毒复制的影响。
结果
1. Lipofermata在imHC和SH-SY5Y细胞系中的抗寨卡病毒活性
Lipofermata在imHC和SH-SY5Y细胞中均表现出有效的抗病毒活性，且细胞毒性较低。在imHC细胞中，其CC50大于20 μM，IC50为1.41 μM。在SH-SY5Y细胞中，CC50同样大于20 μM，IC50为1.11 μM。病毒滴度随lipofermata浓度增加呈剂量依赖性下降。这表明lipofermata在代表主要靶细胞类型的两种细胞中均能抑制寨卡病毒。
2. 寨卡病毒感染上调SH-SY5Y细胞中FATP2的mRNA和蛋白表达
实时荧光定量PCR结果显示，在感染后24小时，寨卡病毒显著上调了SH-SY5Y细胞中FATP2的mRNA表达水平。蛋白质印迹分析进一步证实，在感染后48小时，FATP2蛋白表达也显著增加。这表明病毒感染可能通过上调FATP2来增加细胞脂肪酸摄取，为病毒复制提供更丰富的脂质供给。
3. Lipofermata抑制SH-SY5Y细胞的长链脂肪酸摄取
BODIPY FL C16摄取实验表明，lipofermata能以7.0 μM的IC50有效抑制SH-SY5Y细胞对长链脂肪酸的摄取，且在此短时实验中未观察到细胞毒性。这证实了lipofermata作为FATP2抑制剂的预期功能。
4. Lipofermata降低寨卡病毒感染SH-SY5Y细胞中的磷脂酰胆碱水平
薄层色谱分析显示，寨卡病毒感染显著增加了SH-SY5Y细胞中的PC含量，而2 μM的lipofermata处理可显著逆转这一升高趋势，同时将病毒滴度从4.80 × 106ffu/mL降低至4.13 × 105ffu/mL。磷脂酰乙醇胺（PE）水平也有类似变化趋势，但统计学差异不显著。Lipofermata单独处理对PC水平无显著影响。PC是内质网来源的病毒复制复合体的主要成分，其减少可能损害病毒复制。
5. Lipofermata降低寨卡病毒感染SH-SY5Y细胞中的caspase 3/7和8活性
寨卡病毒感染显著激活了SH-SY5Y细胞中的caspase 3/7和8（外源性凋亡途径），而lipofermata处理（1 μM和2 μM）可显著降低这些caspase的活性。Caspase 9（内源性凋亡途径）活性未受病毒感染或lipofermata的显著影响。与此同时，2 μM的lipofermata将病毒滴度从3.90 × 105ffu/mL降至1.10 × 105ffu/mL。这表明lipofermata不仅能抑制病毒复制，还能减轻病毒诱导的神经细胞凋亡，而后者与新生儿小头畸形的发病机制相关。
6. siRNA敲低FATP2损害寨卡病毒在SH-SY5Y细胞中的复制
通过siRNA转染敲低SH-SY5Y细胞中的FATP2，即使只是中等程度地降低FATP2的mRNA和蛋白表达，也能在不显著影响细胞活力的前提下，显著降低感染后24小时和48小时的寨卡病毒滴度（例如，48小时滴度从2.10 × 107ffu/mL降至1.34 × 107ffu/mL）。这直接证明了FATP2对于寨卡病毒在神经细胞中的复制至关重要。
讨论
本研究首次揭示了寨卡病毒感染会上调神经母细胞瘤细胞中FATP2的表达。FATP2作为脂肪酸摄取的关键转运蛋白，其表达上调可能是病毒为满足复制所需大量脂质而采取的“劫持”策略。FATP2的表达可能受病毒感染激活的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）等核受体调控。
Lipofermata通过抑制FATP2功能，有效阻断了细胞对脂肪酸的摄取。这不仅切断了病毒复制所需的“原料”供应，还特别降低了磷脂酰胆碱（PC）的水平。PC是构成病毒复制复合体膜结构的主要磷脂，其减少可能直接破坏复制复合体的形成和功能，从而抑制病毒基因组的复制。此外，通过FATP2摄取的脂肪酸可能定向用于磷脂酰肌醇（PI）等特定脂质的合成，而这些脂质在招募病毒和宿主蛋白至复制细胞器中起关键作用。
除了直接抗病毒效应，lipofermata还能显著减轻寨卡病毒诱导的外源性细胞凋亡（caspase 8及下游的caspase 3/7）。神经前体细胞的凋亡是寨卡病毒导致胎儿脑发育异常和小头畸形的核心机制之一。因此，lipofermata的这种抗凋亡作用提示其可能具有减轻神经病理损害的潜力，超越了单纯的抗病毒范畴。
尽管在短暂的脂肪酸摄取实验中，lipofermata抑制摄取的IC50（7.0 μM）高于其抗病毒的IC50（~1.1 μM），但在长达48小时的病毒感染实验中，持续的脂肪酸摄取抑制产生了累积效应，导致病毒复制被有效遏制。siRNA敲低实验进一步从遗传学角度证实，即使部分降低FATP2水平，也足以显著抑制病毒产量，明确了FATP2在寨卡病毒生命周期中的必要性。
本研究所用的未分化SH-SY5Y细胞模拟了寨卡病毒的主要靶细胞——神经前体细胞，具有一定的病理相关性。然而，研究也存在局限性，例如未在分化的成熟神经元或原代神经细胞中进行验证，也未涉及动物模型。此外，lipofermata能否透过血脑屏障发挥中枢抗病毒作用，仍有待探索。
结论
综上所述，FATP2特异性抑制剂lipofermata能够有效抑制寨卡病毒在肝细胞和神经母细胞瘤细胞中的复制。其作用机制是通过抑制FATP2介导的脂肪酸摄取，减少细胞磷脂酰胆碱的积累，从而破坏病毒复制环境，并同时减轻病毒诱导的神经细胞凋亡。寨卡病毒本身会上调FATP2的表达，这可能是一种促进自身复制的适应性机制。本研究首次证明了FATP2在寨卡病毒复制中的重要作用，并将其确立为一个全新的抗病毒治疗靶点。鉴于FATP2在胎盘等高危组织中也有表达，靶向FATP2的策略有望为防治寨卡病毒感染及其严重神经系统并发症（如先天性小头畸形）提供新的治疗思路。
