开发一种模块化的点击标记方法，用于生产放射性碘标记的抗体

模块化点击放射性碘标记法显著提升抗体稳定性及靶向效率，通过碘代阿兹ide与ADIBO-抗体偶联，减少抗体结构损伤并降低甲状腺辐射暴露，免疫反应性提高1.6倍。

　　

崔泰铉 | 金秉秀

韩国放射医学科学研究所应用放射化学部门，首尔，大韩民国

摘要

直接放射性碘标记是一种简单方便的抗体标记方法，但存在免疫反应性降低和代谢不稳定的问题。为了解决这些问题，我们开发了一种基于碘叠氮化物（iodo-Azide）和ADIBO-抗体偶联物的模块化点击放射性碘标记策略。与直接标记的[¹²⁵I]碘标记利妥昔单抗相比，所得到的[¹²⁵I]碘叠氮化物-利妥昔单抗表现出大约1.6倍的免疫反应性、更好的血液保留能力，并降低了甲状腺的辐射暴露。这种基于点击化学的方法减少了抗体的损伤并提高了其体内稳定性，显示出其在开发基于碘的放射性药物方面的潜力。

引言

碘-131托西珠单抗（Bexxar）于2003年获得FDA批准，用于治疗接受利妥昔单抗治疗期间或之后病情进展的CD20阳性、复发或难治性低度滤泡性非霍奇金淋巴瘤患者（Friedberg和Fisher，2004）。Bexxar是一种代表性的放射性药物，由标记有放射性碘的抗体组成，具体来说是靶向CD20抗原的小鼠单克隆抗体托西珠单抗与碘-131直接结合（Kaminski等人，2005；Davies等人，2004）。这体现了利用放射性核素标记抗体来靶向和对抗疾病的疗法的进步。遗憾的是，由于市场批准于2014年正式撤销，Bexxar已停止商业销售（Prasad，2014）。尽管已退出市场，这种药物仍然是制药领域发展的一个重要象征（Cicone等人，2023；Durando等人，2024；Zhang等人，2024）。

通过回顾Bexxar等传统直接标记抗体的局限性，我们发现了提高免疫反应性和代谢稳定性的潜在方法。托西珠单抗是一种靶向CD20抗原的小鼠单克隆抗体，它与碘-131直接结合形成Bexxar。传统的直接标记技术使用氯胺-T或碘源将放射性碘氧化并直接引入抗体的酪氨酸残基中（Gupta等人，2014；Haisma等人，1986）。直接标记方法具有简单性和高标记产率的优势，但需要注意的是，该方法在氧化条件下进行，这可能导致抗体三级结构的变性（Kumar和Woolum，2021），从而可能降低免疫活性并增加非特异性结合。此外，直接标记的抗体在人体内可能会被降解酶脱碘，导致功能丧失（Petrov等人，2022）。此外，小鼠抗体还可能在人体内诱导产生人抗小鼠抗体（HAMA），可能导致过敏反应如皮疹或肾衰竭（Khazaeli等人，1994）。HAMA还会降低治疗效果或限制药物的重复使用。本研究的目的是通过解决Bexxar的这些问题来探索提高放射免疫疗法效果的方法，从而促进更广泛使用放射性碘标记抗体的应用。

我们开发了一种残留性假体基团——碘叠氮化物（N-(3-叠氮丙基)-3-碘苯甲酰胺；专利号10-2567786 kr），以及一种利用该基团的模块化点击放射性碘标记方法。该放射性碘标记过程具有模块化特性，体现在逐步的程序序列中。模块化点击放射性碘标记是指在温和的生物条件下，应用点击化学（一种选择性化学反应）来结合分子单体（Im等人，2025；Jeon等人，2015）。本研究基于ADIBO-抗体和碘叠氮化物之间的生物正交反应进行。放射性碘标记的叠氮化物（[¹²⁵I]碘叠氮化物）可以容易地与ADIBO（叠氮苯并环辛炔）残基结合，并通过酰胺键连接到抗体上。我们评估了使用模块化放射性碘标记方法标记的抗体与直接标记方法标记的抗体的体内稳定性，并评估了其免疫反应性。

部分内容

N-(3-叠氮丙基)-3-(三丁基锡基)苯甲酰胺（TBS-Azide）的合成

在氩气（Ar）保护下，准备了一个反应瓶，其中含有3-(三丁基锡基)苯甲酸（345 mg，0.84 mmol）、2-(1H-苯并三唑-1-yl)-1,1,3,3-四甲基氨基四氟硼酸盐（TBTU，350 mg，1.09 mmol）和1-羟基苯并三唑（HOBt，147 mg，1.09 mmol）。向溶液中加入无水二氯甲烷（4 mL）和N,N,N-二异丙基胺（DIEA，0.22 mL，1.26 mmol），并在室温下搅拌10分钟。随后，将二氯甲烷加入反应体系。

结果

TBS-Azide作为碘叠氮化物的前体，以85%的产率合成，随后通过TBS-Azide的放射性碘标记制备了[¹²⁵I]碘叠氮化物。放射性标记产率超过95%（图1）。利妥昔单抗与ADIBO-NHS酯偶联（图2），然后通过点击反应与[¹²⁵I]碘叠氮化物进一步标记得到ADIBO-利妥昔单抗偶联物（图3）。为了找到最佳条件，尝试了不同的利妥昔单抗与ADIBO-NHS酯的摩尔比来制备ADIBO-利妥昔单抗。

讨论

直接标记是一种简单方便的用放射性碘标记抗体的方法（Haisma等人，1986；Tran等人，2009）。然而，它存在一些缺点，限制了放射性标记抗体的应用。直接标记方法涉及将碘结合到抗体的酪氨酸残基上，在此过程中，碘随机结合到多个酪氨酸残基上，导致不同抗体分子上标记碘的数量和位置不均匀。

结论

我们开发了一种利用放射性碘叠氮化物和ADIBO-抗体偶联物之间的点击反应的模块化点击放射性碘标记方法，并将其与直接标记方法进行了比较。使用模块化点击标记方法，在温和的水性条件下成功制备了[¹²⁵I]碘叠氮化物-利妥昔单抗。与直接标记方法相比，点击标记方法对抗体的结构损伤较小，能够提供更稳定的放射性碘标记抗体。

CRediT作者贡献声明

崔泰铉：撰写——初稿、资源获取、项目管理、方法论设计、研究实施、资金筹集、数据管理、概念构思。金秉秀：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化结果展示、验证、监督、研究指导

利益声明

作者声明没有需要披露的利益冲突。

竞争利益声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）通过基础科学研究计划（Basic Science Research Program）的支持，该计划由教育部资助（2020R1F1A1073228）。