鉴定导致刺参（Apostichopus japonicus）皮肤溃疡综合征的新病原菌——盖特布里希瓦氏菌（Shewanella gaetbuli）及其致病机制研究
《Aquaculture Reports》：Isolation of a
Shewanella strain responsible for the skin ulceration syndrome of
Apostichopus japonicus
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刺参皮肤溃疡综合征（SUS）是威胁其养殖业的重要疾病。本文针对辽宁庄河海域患SUS的刺参，从病组织中分离到101株可培养细菌，其中2株产生β-溶血环。攻毒实验证实Shewanella gaetbuli B9株是SUS的致病菌，其注射和浸泡攻击的120小时半致死浓度分别为7.12×105个细胞/克和8.67×105个细胞/毫升。全基因组分析揭示了其以运动性和免疫调节为核心的致病机制，并建立了快速检测方法，为SUS的诊断和防控提供了重要数据。
在海洋的深处，有一种被誉为“海珍之王”的生物——刺参。它不仅味道鲜美，更富含胶原蛋白、氨基酸和多种微量元素，是高端营养食品的代表。在中国，尤其是渤海和黄海海域，刺参养殖已成为水产养殖业的重要支柱。然而，随着养殖规模的快速扩大，病害问题也随之而来，其中一种名为“皮肤溃疡综合征”的疾病尤为棘手。患病刺参体表出现溃疡，摇头晃脑，甚至排出内脏器官，最终溶解成一团粘液状的胶体，死亡率极高，给养殖户带来巨大的经济损失。尽管科学家们已发现多种细菌与此病有关，但对其病原的精准鉴定和致病机制仍缺乏系统认知，这使得有效防控变得困难。为此，研究人员决定深入虎穴，从患病刺参身上找出“真凶”。
为了精准锁定导致刺参皮肤溃疡综合征的元凶，研究人员于2023年10月从辽宁省庄河市石城岛采集了8只自然发病的刺参。这些刺参体表普遍可见明显的皮肤溃疡。研究人员从溃疡组织中分离可培养细菌，并通过溶血实验和细菌攻毒实验筛选致病菌。他们进一步对致病菌进行了形态学、分子鉴定、全基因组测序、代谢谱分析和抗生素敏感性测试，以全面了解其特征。同时，还通过组织病理学分析比较了健康、自然感染和人工感染刺参的组织差异，并基于全基因组数据开发了针对该致病菌的快速检测方法。
2.1. 从自然感染刺参的病组织中分离可培养细菌
从8只自然发病刺参的溃疡组织中，研究人员共分离出101株纯细菌培养物，所有病参均表现出体表溃疡的临床症状。
2.2. 可培养细菌的溶血测试
在分离到的101株细菌中，有两株（标记为B9和B20-1）能够在哥伦比亚血琼脂平板上产生清晰的透明β-溶血环，因此被选中进行后续分析。
2.3. 菌株B9和B20-1的生长曲线与标准曲线
研究人员绘制了菌株B9和B20-1的OD600nm值与细胞计数之间的标准曲线，拟合度良好。生长曲线显示，两者在室温下的对数生长期和平台期细胞浓度存在差异。
2.4. 使用菌株B9和B20-1对刺参进行细菌攻毒实验
通过注射攻毒实验发现，菌株B9对刺参具有致病性，且死亡率随剂量增加而升高，其注射攻毒的120小时半致死浓度为7.12×105个细胞/克。而菌株B20-1在所有剂量下均未导致刺参死亡，表明其无致病性。随后进行的浸泡攻毒实验进一步证实了菌株B9的致病性，其120小时LC50为8.67×105个细胞/毫升。更重要的是，用菌株B9攻毒后的刺参在24小时内就再现了自然感染个体的临床症状——体表出现皮肤溃疡。
2.5. 菌株B9的最佳生长条件
通过正交实验，研究人员确定了温度、盐度和初始pH对菌株B9生长的影响。范围分析和方差分析结果一致表明，盐度是影响菌株B9生长的核心环境因子，而温度和初始pH的影响不显著。理论上最佳的培养条件组合为温度20°C、pH 6.0、盐度30。
2.6. 菌株B9的形态学表征和分子鉴定
菌株B9在2216E琼脂平板上的菌落呈浅黄色，湿润光滑。革兰氏染色显示其为革兰氏阴性杆菌。基于16S rDNA序列的BLAST比对和系统发育树分析表明，菌株B9与盖特布里希瓦氏菌最为相似。全基因组测序显示其染色体总长为4.02 Mb，平均GC含量为40.67%。平均核苷酸一致性分析进一步确认，菌株B9与盖特布里希瓦氏菌的ANI值高达98.69%，确认为同一物种。
2.7. 菌株B9的生理生化特性
利用Biolog Gen III微孔板进行的代谢谱分析显示，菌株B9的代谢特征与盖特布里希瓦氏菌标准株TF-27几乎一致。抗生素敏感性测试表明，菌株B9对阿莫西林、阿奇霉素、诺氟沙星、复方新诺明、氯霉素和多粘菌素B敏感，而对头孢氨苄、青霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素和呋喃唑酮耐药。
2.8. 确认菌株B9对刺参的致病性
为验证菌株B9是导致刺参皮肤溃疡症状的直接原因，研究人员从经菌株B9注射攻毒后出现溃疡的刺参体壁组织中，重新分离出了一株在形态和遗传上与原始菌株B9完全一致的细菌。这符合柯赫法则，证实菌株B9是刺参SUS的病原菌。此外，使用实验室保存的另一株来自菲律宾蛤仔肠道的希瓦氏菌进行模拟攻毒实验，结果显示该菌对刺参无致病性，表明致病性并非希瓦氏菌属的普遍特性，而是菌株B9的特有属性。
2.9. 感染菌株B9的刺参组织病理学分析
对健康、自然感染和人工感染刺参的体壁和肠道组织进行组织病理学比较发现，与健康组相比，两个发病组的刺参体壁肌肉细胞变得松散、形成囊泡，并从基底膜上脱落。肠道组织则出现正常结构排列丧失、胶原纤维断裂破碎、肿胀融合，以及出现嗜碱性包涵体样物质。
2.10. 菌株B9全基因组序列的毒力因子注释
为阐明菌株B9的致病分子机制，研究人员对其全基因组进行了毒力因子数据库注释。功能分类和比例量化结果显示，菌株B9的毒力系统以运动性和免疫调节为核心，粘附等功能为辅。其中，运动性相关基因占比最高，达36.59%；免疫调节相关基因次之，占29.27%；粘附相关基因占14.63%。这表明菌株B9可能主要依靠运动性在宿主组织内扩散和定位感染部位，并通过调节宿主免疫反应来逃避清除。
2.11. 菌株B9的快速检测
基于菌株B9的全基因组数据，研究人员选择luxS基因作为快速检测的靶标，设计了3对特异性引物。聚合酶链式反应（PCR）结果显示，这三对引物均能特异性扩增菌株B9的靶基因片段，而对实验室保存的另一株希瓦氏菌参考株则无扩增产物，测序结果证实了扩增产物的正确性，从而建立了一种快速、特异地检测致病菌株B9的方法。
本研究成功从患有皮肤溃疡综合征的刺参溃疡组织中分离出一株具有β-溶血活性的细菌，经综合鉴定为盖特布里希瓦氏菌，命名为菌株B9。攻毒实验证明，该菌株能通过注射和浸泡途径感染健康刺参，并成功再现SUS的典型临床症状，其注射和浸泡攻击的120小时半致死浓度分别为7.12×105个细胞/克和8.67×105个细胞/毫升。通过从人工感染发病的刺参中重新分离到同一菌株，完全符合柯赫法则，确证了菌株B9是导致刺参SUS的直接病原菌。这是首次报道盖特布里希瓦氏菌作为刺参SUS的致病菌。
研究人员对菌株B9进行了全基因组测序，其毒力因子分析揭示了其致病机制可能以运动性和免疫调节为核心，粘附为辅。此外，研究还确定了盐度是影响该菌生长的最关键环境因子，并开发了基于luxS基因的特异性PCR快速检测方法。这些发现不仅丰富了对刺参SUS病原多样性的认识，为该病的早期诊断和针对性防控（如通过调控养殖水体盐度）提供了重要的理论依据和实践工具，也为未来选育抗病刺参品种奠定了坚实的基础。该研究为解决刺参养殖业中的这一顽固病害提供了新的突破口，具有重要的科学意义和应用价值。
