盐单胞菌（Halomonas）、假变盐单胞菌（Pseudoalteromonas）和短杆菌（Brevibacterium）等与奶酪表皮相关的细菌的完整基因组

奶酪外皮微生物多样性及基因组学研究。从美国佛蒙特州和威斯康星州的3种阿尔卑斯风格奶酪中分离出4株细菌，包括Halomonas、Brevibacterium和Pseudoalteromonas等物种。通过Illumina MiSeq和Oxford Nanopore测序技术解析基因组，发现Halomonas H2和Brevibacterium LE-L ANI值低于物种定义阈值，可能为新型物种。基因组分析显示Pseudoalteromonas KG3含有2个染色体和3个质粒，其他菌株质粒数量不同。

　　

摘要

从奶酪外皮中分离出了四种不同的细菌，通过基因测序进行了鉴定，并使用多种生物信息学工具进行了分析。这些结果为我们提供了关于奶酪外皮微生物多样性的见解，有助于我们了解奶酪微生物组及其在食品微生物学中的作用。

公告

奶酪外皮是一个复杂的微生物生态系统，对成熟奶酪的风味、质地和香气有着重要影响。盐渍、成熟温度和湿度以及清洗技术等环境和生产因素决定了哪些微生物能在奶酪外皮上繁衍（1，2）。研究这些微生物有助于奶酪制造商改进成熟工艺，并更深入地了解在结构化、竞争性环境中的微生物生理学。本研究使用了来自美国佛蒙特州和威斯康星州的三种阿尔卑斯风格硬质奶酪来分离奶酪外皮细菌并测序它们的基因组。

细菌菌株的分离和纯化方法如前所述（3）。具体操作为：无菌刮取1克奶酪外皮（详见表1中的不同奶酪类型），然后将其悬浮在无菌生理盐水中（0.9% NaCl），通过涡旋混合均匀。将100微升的样本液以10倍递增的方式在无菌生理盐水中进行系列稀释，随后接种到改良的平板计数琼脂平板（mPCA，含有22.5 g/L PCA [Oxoid]、1 g/L脱脂牛奶和5 μg/mL万古霉素；添加万古霉素是为了抑制革兰氏阳性细菌），并在30°C下有氧条件下培养3-5天。选取形态各异的菌落，根据DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit（Qiagen）进行DNA提取。使用Illustra/Cytiva PuReTaq Ready-To-Go Beads（Cytiva）和引物616F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）及1492R（5′-GTTACCTTGTTACGACTT-3′）对16S rRNA基因进行PCR分析。通过NCBI BLASTn与NCBI非冗余（nr）数据库进行比对以鉴定分离到的菌株。我们分离出了两种Halomonas属菌、一种Brevibacterium属菌和一种Pseudoalteromonas属菌。对于Halomonas KG2、Pseudoalteromonas KG3和Brevibacterium LE-L，分别在爱荷华州立大学（ISU）的DNA设施中使用Illumina MiSeq和Oxford Nanopore Technologies（ONT）技术进行了测序。Illumina MiSeq文库制备采用NEBNext Ultra II FS试剂盒和标准参数；ONT GridION测序用于KG2、KG3和LE-L，文库制备使用SQK-LSK109试剂盒（未对DNA进行剪切），测序使用X5流式细胞仪和Guppy 6.5.7软件进行碱基调用。Halomonas H2的测序由Plasmidsaurus完成，文库制备使用ONT Rapid Barcoding Kit 96 V14，测序在PromethION P24上进行，使用R10.4.1流式细胞仪，Contigs使用Medaka（v1.11.1）进行校正。基因组测序和组装的详细信息见表1。使用FastQC v0.11.9评估读取数据的质量（除非另有说明，所有软件均使用默认参数）。对于Illumina测序，质量分数低于20的碱基被剔除，接头序列使用BBDuk v37.36去除。Bandage plots（v0.8.1）用于识别完整的环状基因组和质粒。基于基因组的分类鉴定通过JSpecies网站（4）进行，使用平均核苷酸同一性（ANI）ANIb、ANIm和四元相关性搜索方法。KG2与Halomonas和Vreelandella属的各种菌株的ANI最高（约95%）。分离株H2与其他Halomonas菌株的ANI较低，约为83%（重叠度56%）。KG3与Pseudoalteromonas prydzensis DSM 14232的ANI最高（95%，重叠度72%），LE-L与不同Brevibacterium菌株的ANI约为85%（重叠度65%）。Halomonas H2和Brevibacterium LE-L的ANI值低于物种定义阈值（5），可能代表新的物种，需要进一步研究确认。基因组使用BV-BRC服务器（6）和NCBI-PGAP流程进行注释。所有菌株的基因组测序和组装结果均为闭合的环状基因组和质粒（如有）（表1）。Pseudoalteromonas KG3具有两条染色体，而其他菌株均有一条染色体。除LE-L外，所有菌株都携带多个质粒（2到3个）。

表1

表1 奶酪外皮细菌的元数据、测序和基因组特征

CP098528
CP098529
CP098530
CP098531SRX16175526

菌株	H2	KG2	KG3	LE-L
细菌来源和分类
?分类	Halomonas属	Halomonas属	Pseudoalteromonas属	Brevibacterium属
?分离来源	阿尔卑斯风格奶酪（生牛乳），美国佛蒙特州	洗过的外皮半软质奶酪（巴氏杀菌牛乳），美国佛蒙特州	洗过的外皮半软质奶酪（巴氏杀菌牛乳），美国佛蒙特州	阿尔卑斯风格奶酪（生牛乳），美国威斯康星州
基因组测序
?原始Illumina MiSeq读取次数		2,445,127	3,252,352	1,621,460
?Illumina MiSeq读取长度（bp）		250	250	250
?总Illumina MiSeq测序数据（Mbp）		1,222	1,626	486
?原始ONT读取次数	418,198	26,050	41,013	328,704
?平均ONT读取长度（bp）	2,701	15,556	15,289	6,984.5
?总ONT测序数据（Mbp）	1,129	405	627	2,295
?组装
?组装软件	Trycycler v0.5.4	Unicycler v0.4.8	Unicycler v0.4.8	Unicycler v0.4.8
?平均Illumina MiSeq覆盖率		162×	239×	91×
?平均ONT覆盖率	276×	85×	114×	125×
?Contigs数量	3	4	5	1
?组装N50（bp）	3,973,152	4,461,952	3,931,114	4,194,401
?基因组结构	一条染色体，两条质粒	一条染色体，三条质粒	两条染色体，三条质粒	一条染色体
?染色体大小（bp），[GC含量]	3,973,152 [55.1%]	4,461,952 [52.9%]	3,931,114 [41.2%]（染色体1） 1,170,572 [40.7%]（染色体2）	4,194,401 [65.0%]
?质粒大小（bp），[GC含量，覆盖率]	pHaH2_1: 88,701 [51.8%, 72×] pHaH2_1: 5,373 [55.2%, 9,445×]	pHaKG2_1: 98,093 [52.0%, 175×] pHaKG2_2: 4,719 [56.4%, 3,003×] pHaKG2_3: 4,213 [56.3%, 2,150×]	pPsKG3_1: 184,073 [39.5%, 263×] pPsKG3_2: 3,799 [39.6%, 2,708×] pPsKG3_3: 3,140 [40.8%, 3,360×]
?GenBank登录号	CP189760 CP189761 CP189762	NZ_CP098527 NZ_CP098526 NZ_CP098525 NZ_CP098524 NZ_CP098523	CP189759
?Illumina原始读取登录号		SRX16175528	SRX28630252
?ONT原始读取登录号	SRX28630250	SRX16175527	SRX16175529	SRX28630251

致谢

感谢本科生微生物学学生Kelsey Gillam和Logan Engebretson分别分离出了KG2、KG3和LE-L菌株。