通过裂解荧光素酶互补测定法（split-luciferase complementation assay），发现NLRP3的S5D突变体揭示了其在NLRP3炎性小体（inflammasome）复合体中的作用

NLRP3炎症小体激活机制研究中，通过split-luciferase互补系统发现Ser5磷酸化在NLRP3-ASC相互作用中起关键作用，但不影响NLRP3自组装，分子对接显示S5D突变间接破坏Asp31与Arg5的相互作用。

　　

Mojdeh Amandadi | Hadi Ravan | Mohammad Hashemabadi | Saman Hosseinkhani

伊朗德黑兰塔比阿特莫达雷斯大学生物科学学院生物化学系

摘要

NOD样受体（NLR）家族中的含吡啉结构域蛋白3（NLRP3）是检测外源性和内源性危险信号的关键胞质炎症小体传感器，也是治疗炎症性疾病的高度有吸引力的药物靶点。通过NLRP3构象变化及含有CARD（ASC）蛋白的凋亡相关斑点样蛋白介导的NLRP3炎症小体激活的分子机制仍很大程度上尚未明确。本文报道了几种基于裂解荧光素酶互补测定的生物发光NLRP3炎症小体报告分子，用于监测NLRP3炎症小体的结构和分子变化。设计的裂解荧光素酶NLRP3报告分子显示，在静息状态下NLRP3分子彼此紧密相邻，而在尼日菌素刺激下会发生动态重排。该报告分子对MCC950（一种特异性小分子NLRP3寡聚化抑制剂）引起的结构变化具有响应性。研究结果表明，尽管NLRP3的第5位丝氨酸在NLRP3炎症小体调控中起关键作用，但它似乎并非NLRP3寡聚化的必需成分，而是参与NLRP3与ASC的相互作用。为进一步探讨第5位丝氨酸对NLRP3炎症小体功能的影响，我们进行了蛋白质对接模拟。分子建模显示，第5位丝氨酸突变为天冬氨酸会间接破坏NLRP3中的天冬氨酸31位与ASC中的精氨酸5位之间的相互作用。这些发现证明了这些报告分子在监测NLRP3炎症小体内部相互作用方面的实用性，为测量NLRP3炎症小体的动态变化及阐明治疗药物的作用机制提供了平台。

引言

炎症小体是由多种蛋白质组成的复合物，在病原体刺激和内源性危险信号作用下，它们可作为激活炎症半胱天冬酶和处理促炎细胞因子的平台[1][2]。NOD样受体（NLR）家族中的含吡啉结构域蛋白3（NLRP3）是最为人们所熟知的炎症小体，可被多种刺激激活，包括细胞外ATP、孔形成毒素、破坏溶酶体的晶体物质以及β-淀粉样纤维[3][4]。NLRP3是一种三聚体蛋白，包含一个氨基端的吡啉结构域（PYD），该结构域能招募含有半胱天冬酶招募结构域（ASC）的适配蛋白；一个中央的NACHT结构域，对NLRP3的自组装和ATP酶活性至关重要；以及一个羧基端的富含亮氨酸的重复序列（LRR）结构域，具有自我抑制功能。受刺激时，NLRP3会通过PYD-PYD相互作用寡聚化并招募ASC蛋白。ASC蛋白通过CARD-CARD相互作用招募前体半胱天冬酶1，从而形成炎症小体复合物。这一复合物会触发半胱天冬酶1的自切割和激活，进而处理促炎细胞因子（白细胞介素-1β和IL-18），并切割gasdermin D蛋白使其在质膜上形成孔洞，诱导细胞发生焦亡[4][5][6]。 虽然NLRP3对宿主防御多种病原体和维持体内平衡至关重要，但它最初因与多种疾病的发生有关而备受关注，包括自身炎症性疾病、 cryopyrin相关周期性综合征、神经退行性疾病、心血管代谢紊乱以及癌症[2][7][8]。因此，了解NLRP3炎症小体的激活机制及其组成成分间的蛋白质-蛋白质相互作用，有助于更好地解释其在炎症性疾病病理中的作用。这需要借助不仅能探究炎症小体激活机制细节的工具，也能用于筛选针对NLRP3炎症小体成分的抗炎药物[9][10]。 尽管NLRP3炎症小体具有重要的生理功能，但目前可用于检测其激活状态的工具却很少。一些方法主要集中在检测前体半胱天冬酶1和IL-1β的激活[11][12][13][14]，但基于半胱天冬酶1或IL-1β的生物传感器无法区分不同类型的炎症小体激活情况，也无法筛选针对NLRP3的特异性治疗药物[15][16]。最近，一些平台利用NLRP3炎症小体成分的寡聚化来验证其激活情况，这些方法包括融合荧光蛋白或使用荧光抗体进行免疫染色以识别寡聚体的形成[17][18][19][20]。然而，这些方法依赖于蛋白质的共定位，难以区分真正的相互作用和仅仅是空间上的接近[10]。为解决这一问题并提供适用于高通量筛选（HTS）的蛋白质相互作用检测系统，基于生物发光的检测方法为发现针对NLRP3相关炎症的潜在治疗药物开辟了新途径。在这方面，一些基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法已被用于研究炎症刺激下NLRP3炎症小体激活的分布和动力学[20][21][22][23][24]。 为了探索NLRP3炎症小体中蛋白质-蛋白质相互作用的新维度，并提供一个适用于高通量筛选的检测平台以识别NLRP3炎症小体途径中的有效化学化合物，我们在HEK293T细胞中重组了生物发光NLRP3炎症小体。该系统采用了裂解荧光素酶互补测定法，这是一种广泛用于监测各种程序性细胞死亡模式中蛋白质-蛋白质相互作用的成熟方法[25][26][27][28][29][30][31][32][33][34]。我们构建了裂解荧光素酶报告分子，以评估炎症小体复合物中的NLRP3-NLRP3和NLRP3-ASC相互作用。该系统使我们能够研究在已知诱导剂（尼日菌素）和抑制剂（MCC950）作用下的蛋白质接近性和空间组织变化。尽管先前的研究表明NLRP3第5位丝氨酸的磷酸化会抑制其寡聚化[37][38]，但这种修饰在完整NLRP3炎症小体背景下的确切机制仍不够明确。具体而言，该位点磷酸化如何影响NLRP3的自组装及其与适配蛋白ASC的相互作用仍不清楚。此外，大多数先前研究依赖于间接的生化测定或静态结构分析，无法在活细胞中评估蛋白质的接近性。我们之前使用体外裂解荧光素酶测定法研究了Ser5在NLRP3PYD同型相互作用中的作用[39][40]。在本研究中，我们建立了一种裂解荧光素酶互补测定法，可在细胞系统中定量评估NLRP3-NLRP3和NLRP3-ASC相互作用。结合磷酸模拟突变（将Ser5突变为天冬氨酸（S5D）和计算对接技术，我们发现Ser5突变会间接破坏NLRP3中的天冬氨酸31位与ASC中的精氨酸5位之间的相互作用。

质粒制备

人源NLRP3及其突变体（S5D）以及ASC分别通过Prime-STAR GXL DNA聚合酶（TaKaRa，日本）从pEGFP-C2-NLRP3（addgene #73955）和pET28a-ASC（由西班牙Felipe王子研究中心的Mar Orzaez博士提供）中扩增，并克隆到预先构建的pCDNA3.1质粒中，该质粒包含萤火虫荧光素酶的N端（1–416氨基酸）和C端（395–550氨基酸）片段，这些片段通过柔性（Gly₄Ser）连接器连接。

设计用于检测NLRP3炎症小体形成的裂解荧光素酶报告分子

本研究基于裂解荧光素酶互补测定法设计了生物发光NLRP3炎症小体平台。在该系统中，萤火虫荧光素酶的N端（氨基酸1–416）和C端（氨基酸395–550）片段分别通过柔性连接器（Gly₄Ser）与NLRP3蛋白的N端结合。NLuc-NLRP3和CLuc-NLRP3在HEK293T细胞中短暂过表达，其表达通过Western blot分析得到验证。

讨论

NLRP3炎症小体是一个细胞内复合物，包含传感器分子NLRP3、适配蛋白ASC和效应蛋白前体半胱天冬酶1[4]。NLRP3的强大炎症潜力及其在疾病中的关键作用使其成为有吸引力的药理学靶点，这凸显了阐明其信号通路机制的必要性[2]。尽管最近已经解析了活性NLRP3炎症小体的冷冻电镜结构，但其

CRediT作者贡献声明

Mojdeh Amandadi：撰写初稿、数据可视化、验证、软件开发、方法设计、实验实施、数据分析、数据整理。 Hadi Ravan：验证、方法设计。 Mohammad Hashemabadi：验证、方法设计。 Saman Hosseinkhani：撰写、审稿与编辑、实验监督、资源协调、资金获取、概念构思。

未引用参考文献

[36]

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究的资金支持来自塔比阿特莫达雷斯大学研究委员会，通过编号为#IG/39803的资助，用于细胞死亡与分化研究项目。