《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Adhesion GPCR ADGRL1/Latrophilin-1 mobilizes β-arrestins as a prerequisite for endosomal restriction of G protein activation and splice-dependent scaffolds
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本研究发现，在黏附性GPCR（aGPCR）ADGRL1/Latrophilin-1的持续性信号转导中，经典的信号抑制蛋白β-arrestins（βarr）发挥着前所未有的关键作用。与经典GPCR模型的认知不同，ADGRL1的两种剪接变体依赖于βarr和动力蛋白（dynamin）的介导，将G蛋白激活过程限制在内体（endosome）中，并形成了具有剪接特异性的βarr/G蛋白复合物。这一研究揭示了βarr是调控aGPCR信号时空动态和组织过程的核心“组织者”，为理解aGPCR这一重要受体家族独特而复杂的信号转导机制提供了新范式。
在细胞感知外界信号的过程中，G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPCRs）是规模最为庞大的膜蛋白家族。传统观点认为，当GPCR被激活后，会先招募G蛋白启动信号，随后招募β-抑制蛋白（β-arrestin, βarr）来“关停”信号，并使受体进入细胞内部的内体（endosome）中。然而，近年来的研究颠覆了这一认知，发现一些“B类”GPCRs在进入内体后，仍然能够与βarr和G蛋白形成一种名为“巨型复合物（megaplex）”的结构，实现信号的持续传递。那么，在结构、功能和调控机制上都更为复杂的黏附GPCRs（aGPCRs）中，是否也存在这种依赖于内体和βarr的持续性信号传导呢？这正是本研究试图揭示的科学谜题。
研究人员聚焦于一个在神经元突触组织和能量稳态中起关键作用的aGPCR——ADGRL1（亦称Latrophilin-1）。这个受体通过一种名为“剪接位点B（SSB）”的可变剪接，产生两种在细胞内尾巴长度不同的变体（分别标记为 (+SSB)L1 和 (-SSB)L1），这暗示它们可能拥有不同的信号传导“性格”。本研究旨在探究内吞机制（特别是βarr和动力蛋白）如何影响ADGRL1这两种剪接变体的信号传导和细胞定位，以阐明aGPCR区别于经典GPCR的独特信号转导逻辑。
为了回答这些问题，研究人员主要运用了以下关键技术：1）在HEK293细胞中过表达和敲低/敲除内源蛋白，结合免疫荧光共定位和共免疫沉淀技术，研究ADGRL1与βarr的相互作用和亚细胞共定位。2）利用SNAP标签技术和活细胞成像，实时追踪配体刺激下受体内吞至βarr阳性内体囊泡的动态过程。3）采用基于BRET2的生物传感器，实时监测ADGRL1对不同G蛋白家族（Gs, Gi, Gq, G13）的激活。4）通过靶向细胞膜和内体的G蛋白-膜（GaMe）生物传感器以及G蛋白效应物膜转位（GEMTA）生物传感器，剖析G蛋白在质膜和内体膜上的丰度与激活状态。5）构建GαβarrBRET生物传感器，检测ADGRL1活性依赖的βarr/G蛋白复合物形成。
2.1. ADGRL1表现为“B类”βarr相互作用受体
研究人员发现，ADGRL1的胞内尾巴具有多个“B类”GPCR特有的丝氨酸/苏氨酸簇和βarr识别基序。实验表明，βarr的过表达会减少ADGRL1在细胞膜表面的数量，而βarr的敲除则会增加其膜表面表达，这表明βarr促进了ADGRL1的内吞。同样，抑制动力蛋白的活性也会导致ADGRL1在细胞膜上积累。免疫荧光实验清晰地显示，两种剪接变体与内源性βarr在质膜和内体中存在强烈的共定位，并且能与βarr1和βarr2发生共免疫沉淀。更重要的是，当用其配体Neurexin1β长时间刺激时，两种受体变体都会被内吞进入含有βarr的囊泡，且(+SSB)L1的内吞速率比(-SSB)L1快约3倍。这些证据共同表明，ADGRL1符合“B类”GPCR的特征，其内吞依赖于βarr和动力蛋白，并且剪接变体影响了其内吞动力学。
2.2. ADGRL1的持续性信号传导依赖动力蛋白和βarr
出乎意料的是，当研究人员用显性失活突变体（dynDN）抑制动力蛋白功能，或通过RNA干扰（βarrKD）和基因敲除（βarr KO）来耗尽βarr时，ADGRL1变体激活所有四种G蛋白家族（Gs, Gi, Gq, G13）生物传感器的能力被严重削弱。这完全不同于经典GPCR模型，因为在该模型中，去除βarr通常会增强而非减弱G蛋白信号。此外，使用针对细胞膜的“迷你G蛋白”招募实验也未能检测到质膜上存在活跃的ADGRL1。这些结果强烈暗示，ADGRL1介导的G蛋白信号传导严格依赖于其通过动力蛋白和βarr进入内体囊泡的过程，内体运输是维持其信号活性的先决条件。
2.3. ADGRL1剪接依赖的内体信号模式差异性依赖内吞信号
为了精确追踪G蛋白的去向，研究人员使用了靶向质膜和内体膜的生物传感器。他们发现，在ADGRL1高活性状态下，G蛋白在质膜的丰度基本不变，但在内体膜的丰度则表现出剪接变体特异性。(-SSB)L1导致G13和Gq在内体膜富集，而(+SSB)L1则使其耗竭。当抑制动力蛋白功能时，只阻断了(-SSB)L1引起的内体G蛋白富集，而不影响(+SSB)L1的效应。相反，当敲低βarr时，只阻断了(+SSB)L1引起的内体G蛋白耗竭，而不影响(-SSB)L1的效应。更进一步，在βarr KO细胞中，使用GEMTA生物传感器检测发现，ADGRL1激活的G13和Gq蛋白在内体中发生了显著的积累，而在正常细胞中则是减少的。这揭示了βarr是调控ADGRL1激活的G蛋白从早期内体“流出”的关键因子。
2.4. ADGRL1剪接决定了βarr2/Gα蛋白复合物的特性
基于βarr作为内体G蛋白适配器的角色，研究人员探究了ADGRL1是否能促进βarr与G蛋白形成复合物。他们使用GαβarrBRET生物传感器发现，提高ADGRL1的表达水平会以剪接依赖的方式促进特定的βarr2/Gα复合物组装。两种剪接变体都能促进βarr2与Gαs的复合物组装。然而，(-SSB)L1选择性地促进βarr2与Gαq的复合，而(+SSB)L1则选择性地促进βarr2与Gα13的复合。通过结合FRET技术的BRET-FRET实验，研究人员进一步证实了ADGRL1直接参与了Gs/βarr2三元复合物的形成。这些结果说明，ADGRL1的剪接变体通过组装具有不同组成的βarr/G蛋白信号“支架”，从而可能导向不同的下游生物学效应。
本研究通过系统的细胞生物学和生物化学方法，揭示了黏附GPCR ADGRL1信号传导的全新范式。其主要结论是，β-抑制蛋白是ADGRL1介导的持续性信号传导的关键“组织者”，其作用与经典GPCR模型截然相反。
具体而言，1）信号启动依赖内吞：ADGRL1的两种剪接变体在结构上属于“B类”GPCR，其内吞和向含有βarr的内体囊泡的运输依赖于βarr和动力蛋白。2）信号传导的“βarr条件性”：与经典GPCR去除βarr增强信号不同，ADGRL1激活G蛋白的能力严格依赖于βarr的存在。抑制动力蛋白或敲除βarr会严重损害其G蛋白信号，表明其功能性的信号传导主要发生在内体，而非质膜。3）内体是信号整合与分选中心：ADGRL1在内体膜上调控G蛋白的丰度和活性，且这一过程是剪接变体特异性的，并分别依赖于动力蛋白和βarr。在缺乏βarr时，被激活的G蛋白会异常滞留在内体中。4）剪接决定信号复合物身份：ADGRL1促进βarr与G蛋白形成具有剪接特异性的复合物（如(-SSB)L1偏好Gq，(+SSB)L1偏好G13），这为可变剪接如何精确调控aGPCR的信号输出多样性提供了分子机制。5）提出了颠覆性的新模型：该研究将ADGRL1定义为一种“内体依赖、βarr条件性的G蛋白偶联受体”，其信号级联的启动顺序可能是“受体激活→βarr招募与内吞→内体中的G蛋白激活与复合物组装”，而非传统的“G蛋白激活→βarr招募以终止信号”。
这项研究发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》，其重要意义在于首次在aGPCR家族中系统阐述了βarr在G蛋白激活中的正向、必需的“支架”和“适配器”作用，而不仅仅是“信号抑制者”。它突破了经典GPCR信号传导的范式，揭示了内体作为aGPCR核心信号平台的突出地位，并为理解ADGRL1及其家族成员在神经发育、代谢调控等生理病理过程中的复杂功能提供了全新的理论框架。该发现可能为靶向aGPCR的药物开发提供新的思路，例如考虑干预其内体运输或特定的βarr/G蛋白复合物，以实现更精准的调控。
