四跨膜蛋白CD9：横跨多个属的弹状病毒的共性进入受体

这篇研究性论文揭示了四跨膜蛋白CD9可作为多种弹状病毒（包括病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、鳜弹状病毒（SCRV）和水疱性口炎病毒（VSV））的、具有保守功能性的进入受体。该发现阐明了弹状病毒利用宿主表面蛋白进行跨物种感染的共享机制，并鉴定出FDA批准的抗寄生虫药物硝唑尼特（NTZ）可干扰病毒糖蛋白G与CD9的相互作用，从而成为一种潜在的广谱抗弹状病毒候选药物，为理解弹状病毒致病机理和开发新型抗病毒策略提供了关键见解。

　　

本研究在弹状病毒（Rhabdoviruses）宿主范围广泛但进入受体长期不明的背景下，首次鉴定出四跨膜蛋白（Tetraspanin）CD9是横跨多个病毒属的多种弹状病毒的保守功能性进入受体。

LjCD9是VHSV有效进入所必需的

前期转录组学分析将鲈鱼（Lateolabrax japonicus）CD9（LjCD9）与病毒性出血性败血症病毒（VHSV）感染相关联。实验发现，VHSV感染后，鲈鱼多种组织（如肝、肾、鳃、眼、脑）及鲈鱼脑细胞（LJB）中LjCD9的mRNA表达水平显著上调。在细胞中过表达LjCD9可显著增强VHSV感染，提高病毒G、M、N基因的RNA水平及上清液中的病毒滴度，并促进病毒在感染早期的进入。相反，敲低LjCD9则产生相反效果。这些结果表明，LjCD9在VHSV感染的早期步骤中起关键作用。

LjCD9与VHSV G蛋白直接相互作用

弹状病毒的糖蛋白G在病毒通过与宿主受体结合进入细胞的过程中起关键作用。免疫共沉淀（Co-IP）实验证明，VHSV G蛋白与LjCD9蛋白能够相互结合。细胞表面共定位进一步支持了它们的相互作用。体外Pull-down实验和表面等离子共振（SPR）分析证实了二者存在直接的高亲和力相互作用，平衡解离常数（K_D）约为0.12 nM。研究还发现，同为诺维弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的G蛋白也能与LjCD9相互作用，提示鱼类CD9与鱼类弹状病毒G蛋白的相互作用是保守的。通过截短体分析，确定了相互作用的关键结构域：VHSV G蛋白的第四结构域（domain IV）与LjCD9的大胞外环2（EC2）基序。

LjCD9作为受体促进VHSV进入

为确认LjCD9是VHSV的功能性受体，研究人员进行了阻断实验。在体外，用抗CD9抗体或纯化的His-LjCD9蛋白预处理，能显著抑制VHSV进入LJB细胞。在鲈鱼体内，注射抗CD9抗体或预先用His-LjCD9蛋白与病毒孵育，均能降低VHSV引起的死亡率、病毒基因表达和组织病理损伤。此外，在原本不敏感但允许VHSV复制的HEK293T细胞中表达LjCD9，可使细胞变得对VHSV敏感，支持病毒进入和复制，并通过透射电镜、免疫荧光和病毒粒子示踪观察到了病毒与受体结合及内化的过程。

CD9敲除在体内外大幅减弱VHSV感染

通过比较野生型（WT）和CD9敲除（zCD9^?/?）斑马鱼的感染情况，发现CD9敲除斑马鱼在VHSV攻击后存活率显著提高（95% vs 0%），病毒基因表达和组织病理变化也大幅减少。体外实验中，源自zCD9^?/?斑马鱼的细胞，其病毒噬斑形成和病毒基因（G, M）表达均显著降低。重要的是，在zCD9^?/?细胞中外源重新表达鱼类CD9，能以剂量依赖的方式恢复细胞对VHSV的易感性。这些结果证实了鱼类CD9在促进VHSV感染中的关键作用。

CD9是其他弹状病毒（如SCRV和VSV）的共有受体

研究进一步探讨了CD9是否也是其他属弹状病毒的共有受体。对于鳜弹状病毒（SCRV），实验证实其G蛋白能与LjCD9的EC2基序相互作用，亲和力很高（K_D≈ 0.1 nM）。在HEK293T细胞中表达LjCD9，可使细胞获得对SCRV的易感性，病毒能够进入并复制。CD9敲除斑马鱼对SCRV感染的抵抗力也显著增强。这些结果表明LjCD9也是SCRV的病毒受体。

对于水疱性口炎病毒（VSV），研究发现其G蛋白能与人类CD9（hCD9）相互作用。SPR分析证实了VSV G与hCD9的直接结合（K_D= 2.98 nM），与LjCD9也能结合但亲和力稍弱（K_D= 52.77 nM）。结构域图谱显示hCD9的EC2基序对与VSV G的相互作用至关重要。阻断实验表明，用纯化的hCD9蛋白或抗CD9抗体预处理，能显著抑制VSV进入HEK293T细胞。此外，hCD9敲除（hCD9^?/?）的A549细胞对VSV感染的易感性也显著降低。这些发现共同确立了CD9作为VSV的一种新型进入受体，并且其功能在物种间具有保守性。

LjCD9通过CME和CavME途径促进VHSV进入

为了探究LjCD9介导VHSV进入的机制，研究人员首先确定了VHSV进入LJB细胞所依赖的内存途径。使用网格蛋白介导的内存作用（CME）抑制剂（如氯丙嗪CPZ、Dynasore）和小窝蛋白介导的内存作用（CavME）抑制剂（如甲基-β-环糊精MβCD、制霉菌素Nystatin）处理，能剂量依赖性地降低VHSV感染，而巨胞饮抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）则无显著效果。免疫荧光也显示，CME或CavME抑制剂处理减少了细胞内的VHSV G信号。这些结果表明VHSV进入LJB细胞主要依赖于CME和CavME途径。进一步实验发现，在LjCD9过表达的细胞中，CME和CavME抑制剂同样能减弱LjCD9所促进的病毒进入。免疫共沉淀和免疫荧光实验证实了LjCD9与内存途径关键蛋白小窝蛋白-1（Cav1）和AP2（一种CME标志物）存在相互作用和共定位。这些发现表明，LjCD9通过招募CME和CavME机器，在促进VHSV进入细胞的过程中扮演了关键角色。

NTZ通过竞争性结合VHSV G发挥抗病毒活性

基于LjCD9通过结合G蛋白第四结构域发挥受体功能的发现，研究团队以G蛋白第四结构域为靶点，筛选可能干扰此相互作用的小分子化合物。分子对接分析预测，硝唑尼特（NTZ）可能结合到VHSV G、SCRV G和VSV G的第四结构域，且结合位点与CD9的结合位点重叠，提示NTZ可能干扰G蛋白与CD9的相互作用。SPR分析证实了NTZ能直接以高亲和力（K_D= 18.29 nM）结合VHSV G蛋白。在细胞实验中，NTZ处理能显著减少VHSV G与LjCD9的共免疫沉淀，并抑制LjCD9过表达细胞中的VHSV感染。NTZ对VHSV本身也表现出强效的抑制作用，其半数有效浓度（EC₅₀）为3.52 ± 0.58 μM，选择指数较高。机制研究表明，NTZ能抑制VHSV与细胞的结合、内化和进入过程。在鲈鱼体内，NTZ治疗能显著提高VHSV攻击后的存活率（76.2% vs 1.88%）。

NTZ对VSV和SCRV也表现出强效抗病毒活性

鉴于NTZ能靶向保守的G蛋白第四结构域，研究测试了其对其他弹状病毒的效果。对于SCRV，NTZ处理能剂量依赖性地降低感染细胞中的病毒G基因表达。对于VSV，SPR分析证实NTZ能直接高亲和力（K_D= 3.35 nM）结合VSV G蛋白。在HEK293T和LJB细胞中，无论与病毒共处理还是预处理，NTZ都能剂量依赖性地显著抑制假型VSV（表达GFP）和野生型VSV的感染，降低病毒基因表达和病毒滴度。这些结果确认了NTZ对包括VHSV、SCRV和VSV在内的多种弹状病毒具有广谱抗病毒功效，其作用机制很可能通过竞争性抑制G蛋白与受体CD9的相互作用来实现。

讨论

本研究首次揭示了四跨膜蛋白CD9是横跨诺维弹状病毒属、小弹状病毒属和水疱病毒属的多种弹状病毒的保守功能性进入受体。这一发现突破了以往对弹状病毒受体认识多局限于特定物种或毒株的局面，为理解弹状病毒广泛的宿主范围提供了统一的分子机制。CD9与病毒G蛋白的相互作用由其EC2结构域和G蛋白的第四结构域介导，这种相互作用在进化上具有保守性，但也存在亲和力差异，这可能反映了病毒对不同宿主的适应策略。此外，研究阐明了CD9介导VHSV通过网格蛋白和小窝蛋白依赖的内存途径进入细胞的详细过程。更具有重要意义的是，本研究鉴定出已获FDA批准的抗寄生虫药物硝唑尼特（NTZ）是一种潜在的广谱抗弹状病毒药物，它通过靶向病毒G蛋白的保守区域，竞争性干扰其与受体CD9的结合，从而有效抑制多种弹状病毒的感染。这为应对当前水产养殖和兽医领域面临的弹状病毒威胁，以及开发新型抗病毒策略提供了全新的靶点和有前景的先导化合物。未来的研究需要进一步验证CD9在整个弹状病毒科中的普适性，并利用冷冻电镜（cryo-EM）等技术解析CD9-G蛋白复合物的高分辨率结构，以推动基于结构的理性药物设计。