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三阴性乳腺癌治疗纳米平台通过整合声动力疗法、铁死亡、铜死亡和免疫原性细胞死亡实现高效协同抗肿瘤，动物实验证实其安全性和肿瘤抑制效果显著。
朱奇宇|王志发|夏璐|周风卓|周志帅|孙俊芳|李玉璐|王伦旭|李云浩|严柳阳|梅伟|杨青玲|张明亮|王文瑞
蚌埠医学院生命科学学院，中国蚌埠233030
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的亚型，治疗选择有限且预后较差，因此迫切需要新的策略。声动力疗法（SDT）是一种有前景的非侵入性方法，但其临床应用受到传统声敏剂低效性和单一模式限制的制约。在本研究中，我们构建了一种基于锌-铜-铁的层状双氢氧化物（ZnCuFe@LDHs）纳米平台，将SDT与协同性的铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）结合，用于靶向治疗TNBC。
使用4T1细胞进行的体外实验表明，ZnCuFe@LDHs能够有效地被细胞内化并逃逸到溶酶体中。在超声刺激下，该纳米平台在酸性肿瘤微环境（TME）和升高的细胞内谷胱甘肽（GSH）作用下产生大量活性氧（ROS）并释放Cu2?/Fe3?。这些事件通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和积累脂质过氧化物来协同触发铁死亡，同时通过Cu2?过载、线粒体功能障碍、三羧酸循环紊乱和脂酰二氢脂酰胺乙酰转移酶（DLAT）寡聚化诱导铜死亡。此外，ZnCuFe@LDHs还能触发免疫原性细胞死亡（ICD），表现为钙网蛋白（CRT）暴露和高迁移率组盒1（HMGB1）释放，从而促进树突状细胞成熟和抗肿瘤免疫。
使用4T1皮下异种移植模型进行的体内研究证实，ZnCuFe@LDH和超声显著抑制了肿瘤生长，且没有明显的系统性毒性。血清生化分析和主要器官的组织学检查验证了其良好的生物相容性。总体而言，ZnCuFe@LDHs通过整合SDT、铁死亡、铜死亡和免疫原性细胞死亡实现了强大的靶向抗肿瘤效果。这种四模式协同策略为TNBC提供了一种安全且具有临床转化潜力的治疗选择。
引言
乳腺癌（BC）是全球女性健康的主要威胁，其全球负担持续增加。根据国际癌症研究机构（IARC）2022年的估计，全球新诊断出230万例乳腺癌病例，占所有女性癌症的24.5%，约68万女性因此死亡，占女性癌症死亡人数的15.5%[1]。预测显示，到2050年，新病例将增加38%至320万例，死亡人数将增加68%至110万例，低收入和中等收入国家的增幅最为显著[2]。
在三阴性乳腺癌（TNBC）亚型中，缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达。因此，标准的内分泌和HER2靶向疗法无效，使得TNBC成为预后最差的亚型——其5年生存率比非TNBC乳腺癌低15-20%[3]。尽管免疫检查点抑制剂（ICIs）对某些患者有益，但大约70%的患者会发展出原发性或获得性耐药性，这是由于富含M2巨噬细胞和纤维化基质的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）所致[3]。一线化疗使用蒽环类药物和紫杉醇仍是主要治疗方法，但会导致严重的骨髓抑制和胃肠道毒性。因此，开发有效、低毒性和针对性的TNBC治疗方法是一个亟待解决的临床问题。
铁死亡是一种依赖铁的细胞死亡途径，由脂质过氧化（LPO）驱动。TNBC细胞由于铁代谢基因的改变，对铁死亡比正常细胞更敏感[4]。其关键机制是细胞内铁催化芬顿反应产生活性氧（ROS），从而氧化膜脂质并诱导细胞死亡[5]。然而，其临床应用受到铁离子传递不良以及TME中高水平的谷胱甘肽（GSH）和天然铁螯合剂的影响，这些因素会减弱LPO的作用。
铜死亡是一种新发现的铜驱动的细胞死亡途径，其特征是过量的铜引发LPO和线粒体功能障碍（MDF）[6]。TNBC细胞过度表达铜泵ATP7A，破坏铜的稳态，使其对铜死亡具有选择性敏感性[7]。然而，游离铜离子（Cu2?）会迅速被血液蛋白捕获，失去生物活性，而酸性、富含GSH的TME进一步削弱了其细胞毒性[8]。
声动力疗法（SDT）是一种非侵入性抗肿瘤策略，利用超声（US）激活声敏剂，生成羟基自由基（•OH）和其他ROS，这些ROS可以绕过药物外排泵。其临床应用受到传统声敏剂低肿瘤摄取率（约5%）和有限ROS产生的限制[9]。层状双氢氧化物（LDHs）是一类具有可调层间电荷和金属结合能力的纳米材料，可以解决这些限制：（i）掺锌离子（Zn2?）的LDHs可以装载92%的声敏剂，并因其正电荷而将肿瘤积累量增加4.3倍[10]；（ii）Cu2?可以在LDH层内稳定协调，并在pH响应性、超声触发的方式下释放，使细胞内Cu2?水平升高至8.3 μM毒性阈值的12.6 μM以上[10]；（iii）同时释放铁离子（Fe2?/Fe3?）可以触发铁死亡，这与铜死亡产生协同作用。此外，超声诱导的ROS消耗细胞内的GSH，从而消除其对Cu2?和Fe2?/Fe3?的抑制作用，并触发一个连续的生物级联反应，首先诱导铜死亡，进而促进铁死亡的发生。
为了解决TNBC治疗的当前局限性，我们开发了一种基于LDH的治疗系统，整合了SDT、铜死亡和铁死亡（SDT-Cu-Fe/LDHs）。这种掺铜离子的LDH纳米平台在一个颗粒中同时递送声敏剂、Cu2?和Fe2?/Fe3?。超声首先激活声敏剂生成ROS，直接杀死肿瘤细胞；同样的ROS还会耗尽GSH，增强Cu2?和Fe2?/Fe3?介导的细胞死亡途径。重要的是，深穿透超声可以到达皮下转移部位，而铜死亡和铁死亡可以诱导免疫原性细胞死亡（ICD），逆转免疫抑制并增加SDT的免疫调节作用。ICD的特点是细胞表面暴露钙网蛋白（CRT）和高迁移率组盒1（HMGB1）的释放，这有助于树突状细胞（DC）成熟并启动适应性抗肿瘤免疫反应。
总之，我们构建了一种掺铜离子的LDH纳米系统（ZnCuFe@LDHs），结合了SDT、铜死亡、铁死亡和免疫调节。这种多模式协同策略为克服TNBC治疗的当前障碍提供了一种实用的方法，满足了临床对有效且安全的TNBC疗法的迫切需求。
材料与细胞系
所有化学试剂和溶剂均为分析级，市售产品，无需进一步纯化。六水合硝酸锌（Zn(NO?)?·6H?O）、三水合硝酸铜（Cu(NO?)?·3H?O）、九水合硝酸铁（Fe(NO?)?·9H?O）、1,3-二苯异苯并呋喃（DPBF）、还原型谷胱甘肽（GSH）和Coomassie Brilliant Blue G250均购自Aladdin Biochemical Technology（上海，中国）。5,5’-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）购自TCI Development
材料的合成与表征
最初，通过水热法和共沉淀法合成了锌-铜-铁层状双氢氧化物（ZCF@LDHs）（图2a），并进行了系列系统表征以验证其形态、结构和生物安全性。首先，通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征了ZCF@LDHs纳米粒子的形态和大小。如TEM图像（图2b）所示，ZCF@LDHs纳米粒子呈现六边形结构
讨论
作为一种高效的纳米声敏剂，ZnCuFe@LDH相比其他先进的纳米平台（例如TiO?纳米粒子、MnO?纳米粒子、MOF基材料、2D MBene纳米片、AIE点、MnTTP-HSA）具有明显优势，包括强大的活性氧（ROS、•OH和O?）生成能力、优异的生物相容性（低细胞毒性和可降解性）、出色的生理稳定性和易于改性[35]。这些综合优点为其卓越的SDT效果奠定了坚实基础
结论
在这项研究中，我们合理设计了一种双响应性的ZnCuFe@LDH纳米平台，整合了声动力疗法（SDT）、铜死亡和铁死亡，用于靶向治疗三阴性乳腺癌（TNBC）。
该纳米平台表现出规则的分层结构、优异的分散性和强大的声敏活性——高效生成ROS，耗尽GSH，并在超声作用下诱导轻微的热疗效应。在4T1细胞中内化并逃逸到溶酶体后，释放Cu2?/Fe3?
CRediT作者贡献声明
朱奇宇：撰写——初稿，概念构思。王志发：撰写——初稿，概念构思。夏璐：撰写——初稿，实验研究。周风卓：撰写——审稿与编辑。周志帅：验证。孙俊芳：方法学研究。李玉璐：验证。王伦旭：方法学研究。李云浩：验证。严柳阳：方法学研究。梅伟：撰写——审稿与编辑。杨青玲：撰写——审稿与编辑。张明亮：资金获取，概念构思。王文瑞：
机构审查委员会声明
该动物实验经过了安徽省实验室动物管理和伦理委员会以及蚌埠医学院伦理委员会的审查和批准，伦理批准号为[2025] No. 785。所有实验均按照《动物管理规定》和《医学实验动物管理规定实施细则》进行。
写作过程中生成AI和AI辅助技术的声明
声明：作者确认在创作过程中未使用任何人工智能工具。所有内容均由作者独立开发，他们对材料的完整性和原创性负全责。资助
本研究得到了2025年高校中青年学科带头人培训计划（DTR2025029）、安徽省教育厅重大自然科学研究项目（2025AHGXZK20042）、蚌埠医学院自然科学一般项目（2024byzd033）、安徽省新时代研究生学术创新项目（2024xscx137）的支持致谢作者感谢安徽省肿瘤进化与智能诊断和治疗重点实验室提供实验材料和设施
