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多靶点COX-2选择性抑制剂的设计与活性研究：合成18个嘧啶衍生物并评估其抑制COX-1/2、5-LOX及抗氧化活性，其中化合物7j对COX-2抑制活性最强（IC50=0.678 μM，SI=29），化合物6表现出协同抑制5-LOX和IL-6的潜力，并通过分子对接验证了作用机制。
阿斯玛·埃萨姆（Asmaa Essam）| 尼尔米娜·A·奥斯曼（Nermine A. Osman）| 莫阿塔兹·A·沙尔达姆（Moataz A. Shaldam）| 哈南·A·阿卜杜勒-法塔赫（Hanan A. Abdel-Fattah）| 阿曼尼·M·加尼姆（Amany M. Ghanim）
埃及扎加齐格大学药学院药物有机化学系，扎加齐格44519
摘要
多靶点抑制剂被认为是开发有效抗炎药物的合理方法。在本研究中，设计、合成了一系列嘧啶衍生物（5a-c, 6, 7a-n），并检测了它们在体外抑制COX-1和COX-2活性的潜力，并与已知的COX抑制剂塞来昔布（celecoxib）和双氯芬酸钠（diclofenac sodium）进行了比较。最具活性和选择性的COX-2抑制剂7j表现出更高的效力和对COX-2的更强选择性（IC50 = 0.678 μM，SI = 29），优于塞来昔布（IC50 = 0.799 μM，SI = 24.61）和双氯芬酸钠（IC50 = 4.812 μM，SI = 2.55）。此外，化合物7d和6的COX-2抑制效果超过了双氯芬酸钠，并与塞来昔布相当，其IC50值分别为0.724 μM和0.824 μM。这些有前景的COX-2抑制剂还在体外进一步评估了它们对5-LOX、IL-6和ROS的抑制活性。化合物6对5-LOX的抑制活性更强（IC50 = 0.235 μM），优于参考化合物齐留通（zileuton，IC50 = 0.334 μM）。有趣的是，化合物6在LPS激活的RAW 264.7巨噬细胞中抑制了96.11%的IL-6产生，优于塞来昔布（86.60%）和双氯芬酸钠（67.83%），并且其IC50为28.26 μg/ml，低于塞来昔布（114.16 μg/ml）和双氯芬酸钠（87.75 μg/ml）的IC50值。分子对接研究探讨了新合成抑制剂与COX-2和5-LOX活性位点之间的结合相互作用。此外，还利用了各种在线工具来评估最活跃化合物的药代动力学、药物相似性和毒性。
引言
炎症是机体对病原体和损伤等有害刺激的初始防御反应，表现为疼痛、红肿和发热[1]。它涉及一系列生化事件以及由炎症介质引发的白细胞向受损组织的迁移，导致血管扩张和血管通透性增加。炎症可以是急性的，即快速且短暂的；也可以是慢性的，随着时间的推移发展并可能导致多种健康问题，如癌症、肥胖、神经系统疾病和哮喘[2]。花生四烯酸通过两种酶——环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）作为生物底物。COX分为三种异构体：COX-1（组成型酶）；COX-2（诱导型酶）；以及存在于中枢神经系统中的COX-3。COX-1参与生理前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的生成，这些物质负责保护胃黏膜、维持正常的肾功能和血小板聚集，因此被称为“管家”酶。相比之下，COX-2参与病理前列腺素的生成，这些前列腺素是炎症过程的原因[3]。最常见的非甾体抗炎药（NSAIDs）同时抑制COX-1和COX-2，导致严重的副作用，如胃肠道溃疡、出血和肾功能障碍[4]。选择性COX-2抑制剂（COXIBS）解决了这些问题。但需要注意的是，提高对COX-2的选择性会减少PGI2和TXA2的生成，而这两种物质具有血管扩张和抗聚集作用[5]。因此，目前的趋势是设计选择性COX-2抑制剂，同时保持对COX-1的有限抑制作用，以减少心血管并发症。
在COX途径中阻断花生四烯酸（AA）的代谢途径会将其导向LOX途径。该途径将花生四烯酸转化为多种白三烯，这些白三烯是许多炎症性疾病（包括哮喘、银屑病和类风湿性关节炎）中的炎症介质[6]。开发能够同时抑制COX和LOX酶的化合物是药物化学中的一个有趣方向，旨在生产具有更好安全性的有效抗炎剂。另外，炎症也可能由活性氧（ROS）的过度产生引发，这会导致氧化应激并促进细胞凋亡，从而加剧炎症[7]。因此，开发同时具有抗氧化活性的双重COX/LOX抑制剂是治疗炎症性疾病的有前景的治疗策略。
值得注意的是，几种临床使用的NSAIDs含有嘧啶作为药效团，包括普罗夸宗（proquazone）、埃皮里唑（epirizole）和化合物PNU-142731 A，它们是选择性COX-2抑制剂（图1）[8]、[9]、[10]。
此外，还合成并评估了含有嘧啶环的新候选化合物作为抗炎剂。嘧啶-2-硫醇衍生物I通过嘧啶-2-硫醇骨架的作用表现出良好的COX-2抑制特性[11]。在另一项研究中，吡啶[2,3-d]嘧啶衍生物II显示出选择性的COX-2抑制活性。对接研究显示，三甲基苯环和氰基对于与COX-2活性位点形成四个氢键至关重要（图2）[12]。
另外，抑制LOX途径也是开发有效抗炎药物的有前景的方法，例如二氢嘧啶-磺酰胺杂化物III，其活性是美洛昔康（meclofenamate）的3倍，且没有胃肠道副作用。此外，它显著降低了促炎细胞因子TNF-α和IL-6的水平[13]。此外，嘧啶-5-碳腈IV与参考药物美洛昔康钠相比显示出显著的LOX抑制作用。值得注意的是，将这些化合物中的羧酰胺连接剂与疏水部分结合使它们变得更庞大，表现出对COX-2的显著选择性抑制作用。它们还减少了主要的促炎细胞因子IL-6和TNF-α的生成（图3）[14]。
此外，嘧啶-肼杂化物在开发抗炎剂领域也受到了关注。化合物V通过两个氢键与COX-2活性位点紧密结合，这得益于氢键受体羰基和肼基的存在[15]。2-肼基-1,6-二氢嘧啶-5-碳腈衍生物VI在体外表现出良好的抗炎活性，并能有效清除一氧化氮和过氧化氢，其IC50值分别为44 μg/ml和29 μg/ml（图4）[16]。
在本研究中，我们设计并合成了一系列基于6-氧代二氢嘧啶-5-碳腈的新化合物5a-c和7a-n，以及一种嘧啶-肼杂化物6，作为多靶点导向配体（图5）。这种设计允许结合不同大小和极性的各种药效团，以满足与COX和LOX酶活性位点结合所需的分子功能特征。新合成的多功能嘧啶在体外进行了评估，以确定它们对抑制COX-1和COX-2同工酶的影响，并计算了选择性指数。此外，最具活性和选择性的COX-2抑制剂还对其抑制炎症细胞因子IL-6、氧化应激指标ROS以及5-LOX酶的活性进行了检测。分子建模研究用于解释所获得的生物学结果。
化学部分
化学
1,6-二氢嘧啶-5-碳腈衍生物4的合成是通过广泛认可的三元缩合反应实现的，该反应涉及芳醛、乙基氰基乙酸酯和N-甲基硫脲在乙醇中的回流反应，使用碳酸钾作为碱（方案1）[16]。
随后在无水碳酸钾存在下，使用适当的烷基卤化物在DMF中对化合物4进行S-烷基化，得到了所需的烷基硫化合物5a-c（方案2）。
结论
总之，设计、合成并评估了一系列十八种多功能嘧啶（5a-c, 6, 7a-n）的体外COX-1和COX-2抑制活性。进行了结构-活性关系（SAR）分析，研究了嘧啶药效团C2位点上不同功能基团的效应。大多数化合物在微摩尔浓度下表现出抑制作用，并对COX-2具有显著的选择性。
化学
使用硅胶预涂层的铝片（类型60 GF254；Merck，德国）进行薄层色谱（TLC）监测反应，并检查了化合物的纯度。通过将铝片短暂暴露于λ 254 nm的紫外光下识别斑点。熔点使用Stuart熔点仪测定，未进行校正。质谱、元素分析（C、H、N）和红外光谱在区域真菌学中心进行。
CRediT作者贡献声明
阿斯玛·埃萨姆（Asmaa Essam）：撰写——初稿、验证、资源、方法学、正式分析、数据管理。尼尔米娜·A·奥斯曼（Nermine A. Osman）：撰写——审阅与编辑、监督、资源。莫阿塔兹·A·沙尔达姆（Moataz A. Shaldam）：撰写——审阅与编辑、软件。哈南·A·阿卜杜勒-法塔赫（Hanan A. Abdel-Fattah）：撰写——审阅与编辑、监督。阿曼尼·M·加尼姆（Amany M. Ghanim）：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、软件、资源、正式分析、数据管理、概念化。
利益冲突声明
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