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软骨素-6-O-硫转移酶基因钓鱼筛选及理性设计显著提升硫化率至86.4%，构建整细胞催化系统实现12.9g·L?1产率，阐明硫磺基团选择性转移机制。
孟伟伟|高梦健|李璐璐|刘丽明|李晓敏|魏婉清|吴静
江南大学生命科学与健康工程学院，中国无锡214122
摘要
骨关节炎仍然是一个全球性的健康问题，而硫酸软骨素C（CSC）对治疗关节炎非常有效。CSC的生物合成提供了一种可持续且具有前景的替代方法，可以替代从动物组织中提取的方法。然而，软骨素-6-O-硫酸转移酶的稀缺及其较低的催化性能严重阻碍了CSC的大规模生物合成。为了克服这些限制，通过基因钓取技术从Rattus norvegicus（RnCHST3）中鉴定出一种新型的软骨素-6-O-硫酸转移酶，该酶能够在软骨素的6位将硫酸基团从3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐（PAPS）转移上去。通过优化表达条件并截短N末端区域，硫酸化速率从4.6%提高到了11.5%。首次通过分子动力学（MD）模拟和定点突变揭示了RnCHST3的区域选择性机制。基于这一机制的合理设计开发出了突变体M5，其硫酸化速率提高到了46.2%。此外，还开发了一种新的“物理筛选”引导的PROSS设计，以提高热稳定性，得到了突变体M7。这种变体的半衰期从9.4小时延长到了12.3小时，硫酸化速率达到了74.5%。最终构建了一个全细胞催化系统用于CSC的生产，达到了86.4%的硫酸化速率和12.9克/升的产量——这是迄今为止报道的最高水平。这项研究为CSC的工业生物合成奠定了坚实的基础。
引言
糖胺聚糖（GAGs）是广泛用于化妆品、健康产品以及关节炎和癌症临床治疗的功能性多糖（Zhang等人，2020年）。根据单糖组成和硫酸化模式，GAGs被分为四类：透明质酸、肝素硫酸盐/肝素、硫酸软骨素/硫酸皮肤素和硫酸角质素。硫酸软骨素C（CSC）被称为“关节黄金宝”，主要作为膳食补充剂用于维护软骨健康，因为它在维持结缔组织健康和确保关节正常功能方面起着关键作用（Bui等人，2024年；Meng等人，2023年）。此外，CSC在预防脑血管疾病、促进神经发育和参与癌症治疗中也起着重要作用（Manton等人，2007年；Palhares等人，2019年；Silver和Silver，2014年）。
目前，CSC的工业生产是从动物结缔组织中提取的，但这存在能耗高、环境污染和产物纯度低的问题（Shen等人，2023年；Volpi，2019年）。为了解决这些问题，人们尝试使用单糖作为底物通过化学聚合合成均一的CSC四糖，但该过程复杂且条件苛刻（Gama等人，2006年）。虽然使用大肠杆菌从头合成软骨素，但化学催化剂催化的硫酸化速率仅为47%，且区域选择性较差（Bedini等人，2011年）。生物合成是一种绿色且可持续的替代方法，因为它具有高选择性和温和的反应条件。然而，从头合成CSC尚未实现。软骨素6-O-硫酸转移酶（C6ST）是一种能够将硫酸基团从3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐（PAPS）转移到软骨素GalNAc 6位的酶。这种酶最初是在鸡胚胎软骨细胞中发现的（Fukuta等人，1995年）。值得注意的是，从Mus musculus中分离出了糖基化的软骨素6-O-硫酸转移酶，5毫克的纯化酶在48小时内能够催化100毫克的软骨素，硫酸化速率为96%（Zhou等人，2018年）。然而，复杂的酶纯化过程以及昂贵且不稳定的硫酸供体PAPS严重阻碍了CSC的工业生物合成（An等人，2017年）。
因此，我们假设通过基因钓取可以鉴定出高效的C6ST，从而获得均一的CSC，并通过表达优化和截短修饰提高其溶解性。此外，合理的设计可以进一步增强其活性和热稳定性。一个包含PAPS合成、PAPS和ATP再生以及软骨素硫酸化的整个细胞催化系统可以作为概念验证，以证明CSC高效生物合成的可行性。
章节片段
一般信息
所有菌株和质粒的详细信息列在补充材料中。所有引物设计也列在补充材料中。商业试剂、标准和溶剂均购自Sigma-Aldrich（中国上海）、Meryer Chemicals（中国上海）、Aladdin Reagents（中国上海）、Macklin Reagent（中国上海）和Bide Chemicals（中国上海），使用前无需进一步纯化。
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鉴定一种新型的软骨素6-硫酸转移酶
软骨素6-硫酸转移酶（C6ST）利用3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐（PAPS）作为硫酸供体，催化软骨素6位羟基的硫酸化反应（图1a）。根据数据库搜索和文献报道（Yalcin等人，2011年），编码C6ST的基因被确定为CHST3和CHST7。鉴于CHST3与CHST1之间的进化亲缘关系（Sun等人，2022年），将CHST1、CHST3和CHST7纳入了基因筛选范围。
结论
总之，从Rattus norvegicus中鉴定出一种新型的区域选择性软骨素-6-O-硫酸转移酶（RnCHST3）。通过表达优化和N末端截短，其硫酸化速率从4.6%提高到了11.5%。首次通过综合分子动力学模拟和定点突变阐明了其区域选择性机制。通过基于机制的合理设计和PROSS辅助策略开发的突变体M7表现出更好的热稳定性。
CRediT作者贡献声明
孟伟伟：撰写初稿、验证、软件应用、方法学设计、实验研究、数据分析。高梦健：验证、方法学设计、实验研究。李璐璐：验证、实验研究。刘丽明：资源获取、方法学设计、数据分析。李晓敏：方法学设计、资金申请、数据分析。魏婉清：撰写修订稿、监督工作、软件应用、方法学设计、资金申请、数据分析。吴静：监督工作、项目管理、方法学设计、资金申请
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2023YFA0914300）、国家自然科学基金青年项目（22407051）以及国家自然科学基金一般项目的支持。
