基于结构导向的多策略工程改造3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶，以提升其催化性能，并实现(11α)-11,17-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮的高效酶促合成

通过定向进化与半理性设计优化了Mycobacterium neoaurum的KstD2酶，获得高活性突变体ISM-2（Q551R/I468N/R48N/M157A），其催化效率提升3.9倍，热稳定性和pH耐受性显著增强。分子动力学模拟显示活性位点刚性增加、结合腔扩大及氢键网络重构是关键机制。5L发酵规模验证显示该酶可高效转化前体合成糖皮质激素关键中间体。

　　

罗亮丽|黄长顺|岳俊豪|岳金鸽|刘波|杨思|郭秀敏|詹世杰|严一文|胡玉佳|左培文|欧志敏

浙江工业大学药学科学院，浙江省化学药物绿色制造技术重点实验室，杭州 310014，中国

摘要

3-酮类固醇-Δ¹-脱氢酶（KstDs，EC 1.3.99.4）是类固醇C1,2-脱氢反应的关键生物催化剂，该反应引入Δ¹双键以显著增强药理活性。然而，天然KstDs的催化效率和稳定性往往无法满足工业需求。在本研究中，我们从Mycobacterium neoaurum DSM 1381中改造了KstD₂，用于其底物(11α)-11,17-二羟基孕烯-1,4-二烯-3,20-二酮的脱氢反应，该底物是糖皮质激素合成的关键前体。通过半理性设计和定向进化的结合方法，我们获得了性能更优的突变体ISM-2（Q551R/I468N/R48N/M157A），其催化效率（kcat/Km）比野生型高3.9倍。同时，热稳定性和pH耐受性也得到了显著提升。分子动力学模拟表明，催化性能的提高源于底物结合腔的扩大、氢键网络的重新配置以及活性位点刚性的增加。在5升规模的分批生产中，120克/升的底物被高效转化为112.4克/升的产品。这项工作提供了一种高效且稳定的KstD₂变体，为类固醇脱氢酶的工程化提供了战略框架。

引言

类固醇是一类以环戊烷并多苯环为核心结构的天然化合物，广泛存在于植物、酵母和真菌中（Luo等人，2020年；Wójcik等人，2021年）。这些化合物具有多种生理活性，包括激素调节、抗肿瘤作用和抗炎特性（Tong和Dong，2009年；Williams，2018年）。目前，类固醇药物是市场上最重要的药物类别之一，主要包括皮质类固醇、性激素和孕激素。这类药物是使用量第二大的药物类别，仅次于抗生素（Peng等人，2021年；Tong和Dong，2009年；Zhao等人，2023年）。其中，糖皮质激素是一类具有抗过敏、抗风湿和免疫抑制作用的类固醇药物。(11α)-11,17-二羟基孕烯-1,4-二烯-3,20-二酮（DD）是糖皮质激素的关键前体，用于合成泼尼松醋酸酯等药物。DD可以通过3-酮类固醇-Δ¹-脱氢酶的催化作用由11α,17α-二羟基孕酮（DP）生物转化而来。

酶促反应可以将双键引入类固醇底物中，显著提高其生物活性和经济价值（Wang，2017年；W. Zhang等人，2013年）。例如，在氢化可的松醋酸酯中引入C1-C2双键后，可以产生泼尼松龙醋酸酯，其抗炎活性提高了3-4倍（Costa等人，2020年；H. Zhang等人，2013年）。然而，类固醇的化学脱氢过程常常存在区域选择性和立体选择性差、步骤复杂以及需要有毒试剂（如吡啶、SeO₂）和过渡金属（Ghosh等人，2012年；Iida等人，2014年；Khan和Asiri，2018年；Marcos-Escribano等人，2009年）的问题。尽管传统的微生物Δ¹-脱氢酶在一定程度上克服了这些缺点，但其工业应用受到野生型酶活性低、易产生副产物和底物降解等限制（Jia等人，2021年；Luo等人，2021年）。因此，开发高效且特异性的酶促脱氢方法对于类固醇药物的环保生产至关重要。

3-酮类固醇-Δ¹-脱氢酶（KstD，EC 1.3.99.4）是一种依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的酶，广泛存在于多种降解类固醇的细菌中，包括Mycobacterium（Zhang等人，2018年；Wang等人，2022年）、Rhodococcus（Maltseva等人，2024年；Zappaterra等人，2021年）、Pseudomonas（Adham等人，2003年）、Gordonia（Zhang等人，2015年）和Nocardia（Itagaki等人，1990b）。它在微生物类固醇代谢中起着关键作用。相关研究表明，类固醇底物的脱氢反应是通过1α, 2β氢原子的trans-轴向消除启动的（Ringold等人，1963年）。目前普遍接受的假设认为，整个Δ¹-脱氢反应遵循乒乓式双酶机制（Glanowski等人，2021年；Wójcik等人，2023年）。Ali Rohman等人通过整合序列和结构信息进一步阐明了该酶的催化机制。他们确定了KstD1中的关键活性位点残基：Y119、Y318、Y487和G491。Tyr487和Gly491通过增强底物C2氢原子的酸性协同促进酮醇互变异构。Tyr318和Tyr119分别与FAD相互作用，分别负责质子和氢离子的抽取（Itagaki等人，1990年；Ringold等人，1963年；Rohman等人，2013年）。

本研究聚焦于来自Mycobacterium neoaurum DSM 1381的KstD₂（GenBank: MG251736.1）。我们采用了定向进化和半理性设计的策略，获得了具有协同增效的突变体ISM-2（Q551R/I468N/R48N/M157A）。随后通过分子对接、氢键网络分析和分子动力学模拟阐明了这些改进的结构基础。此外，我们还通过高密度发酵与分批处理的结合，评估了这种工程化酶的放大潜力。这种蛋白质工程与发酵优化的结合方法为高性能KstD₂菌株的制备提供了实用途径，支持了3-酮类固醇-Δ¹-脱氢酶的绿色生物制造。

材料

质粒提取试剂盒和In-Fusion? HD无缝克隆试剂盒（用于同源重组）购自TaKaRa。Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、2×ClonExpress Mix以及< />E. coli DH5α

突变体文库的构建

本研究使用易出错的PCR方法创建了突变文库，并研究了不同浓度Mn²⁺（0.05–0.4 mM）对碱基突变率的影响。扩增产物被克隆到pET28a载体中，阳性克隆被随机选取进行测序分析。结果显示，在0.35 mM MnCl₂条件下，KstD₂基因出现碱基缺失；而在0.1 mM MnCl₂条件下，平均突变率为0.4%。因此，确定0.1 mM MnCl₂为最佳浓度

结论

在本研究中，通过定向进化和半理性设计对Mycobacterium neoaurum来源的KstD₂进行了改造，以提高其对DP的转化活性。四重突变体ISM-2（Q551R/I468N/R48N/M157A）的催化效率（k_cat/K_m）提高了3.9倍，同时热稳定性和pH稳定性也得到了改善。分子动力学模拟表明，活性中心的刚性增强、底物结合腔的扩大以及氢键网络的重构是这些改进的原因

原创性和提交声明

我们特此确认：题为“结构引导的多策略工程化3-酮类固醇-Δ¹-脱氢酶，以提高催化性能和(11α)-11,17-二羟基孕烯-1,4-二烯-3,20-二酮的酶促合成效率”的手稿尚未以任何形式发表。该手稿未在其他任何语言的期刊中考虑发表，其内容也未被分割或提交给多个期刊。所有作者均已批准

版权和发表后事项

如果本文被接受，未经版权所有者（Elsevier）书面同意，不得以相同形式重新发表。

伦理声明

作者无需报告任何事项。

CRediT作者贡献声明

罗亮丽：写作 – 审稿与编辑，初稿撰写。黄长顺：软件开发、方法学设计、数据管理。岳俊豪：实验研究。岳金鸽：结果验证。刘波：实验监督。杨思：数据分析。郭秀敏：数据可视化。詹世杰：概念设计。严一文：结果验证。胡玉佳：实验研究。左培文：数据分析。欧志敏：写作 – 审稿与编辑，实验监督，项目管理，资金筹集，概念设计。

资助

本研究得到了浙江省科技计划项目（2024C03014）和国家自然科学基金（21978267）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了浙江省科技计划项目（2024C03014）和国家自然科学基金（21978267）的支持。作者感谢同事们提供的技术帮助。