在两阶段卤碱嗜性共培养条件下，由Phaeodactylum tricornutum和Cryptococcus curvatus共同作用，显著增强了微生物脂质的产生

两阶段盐碱适应型共培养系统提升微藻-酵母协同产脂效率，有效克服海水非无菌培养基的高盐（5.4%）、高pH（10.0）及木质纤维素水解液中的酚类抑制剂限制，脂质产量较单培养提高189%-354%。

　　

郝恒森|拉苏尔·卡马尔|罗佳熙|易俊波|胡张莉|王朝阳

中国广东省深圳市深圳大学生命科学与海洋学学院海洋藻类生物工程技术研究中心，邮编518055

摘要

微生物脂质是具有前景的生物能源原料，但受到产量低、底物和灭菌成本高、溶解氧（DO）限制以及对木质纤维素生物质（LCB）抑制剂耐受性差等因素的制约。本研究开发了一种两阶段卤碱ophilic共培养方法，利用藻类Phaeodactylum tricornutum和酵母Cryptococcus curvatus，将多个工业相关因素整合到一个过程中，实现在基于海水的非无菌培养条件下、低氧转移（OT）环境下、高盐度和pH值以及LCB衍生酚类抑制剂存在的情况下仍能稳定生产脂质。在两阶段培养中，当菌种接种比为1:1（w/w）时，产脂量为7.2克/升，脂质含量为46.4%，脂质产率为0.242克/克葡萄糖，相比在同一条件下单独培养的脂质总量提高了2.9倍（189%）。同样，在菌种接种比为1:1的情况下，即使在低氧转移条件下，共培养系统也能保持稳定的脂质生产，产脂量为5.0克/升，比单独培养的总产脂量（1.8克/升）提高了2.8倍（178%），这证明了该共培养系统的稳健性。此外，该系统还能在pH值为10的海水培养基中实现非无菌脂质生产。在含有1.1克/升香草醛的合成LCB水解物中，菌种接种比为1:1的两阶段共培养产脂量高达5.2克/升，脂质含量为44.8%，比单独培养的总产脂量提高了4.5倍（354%）。这种共培养方式提高了糖的利用效率，增强了培养系统的稳定性，并能耐受高盐、高pH值和香草醛等压力。这些结果为下一代微生物脂质生物炼制技术的发展提供了方向。

引言

微生物脂质主要由三酰甘油（TAGs）组成，在食品、能源和油脂化工领域具有潜在应用价值，是植物和植物油可持续的替代品（Du等人，2019年；Patel等人，2020年）。它们具有高能量密度和良好的燃料互溶性，并解决了与油料作物相关的可持续性问题（Li等人，2008年；Nigam和Singh，2011年）。在产油微生物中，酵母和微藻特别具有吸引力（Adrio，2017年；Li等人，2008年），并被提议作为可持续生物炼制的替代脂质生产菌（Patel等人，2016年）。然而，它们的工业发展受到昂贵底物、能耗高的发酵过程以及低脂质产量的限制（Carriquiry等人，2011年；Du等人，2019年；Soccol等人，2017年）。

目前的工业生物工艺主要依赖于单一菌种培养，这常常面临成本和生产力方面的重大挑战（Huang等人，2022年）。酵母培养过程中存在溶解氧（DO）不足的问题，这限制了生长和脂质的生产（Wang等人，2020年）。此外，酵母还会将大量碳转化为二氧化碳（CO₂）和有机酸等副产物，从而降低了单位底物的脂质产量。这些副产物的积累进一步抑制了细胞生长（Liu等人，2015年）。另一方面，微藻在自养培养条件下可以以极低的底物成本生产脂质（Chia等人，2018年；Olabi等人，2023年）。然而，这一过程的可行性受到生长缓慢、脂质产量低和发酵时间长的限制（Nagappan等人，2019年）。技术经济分析（TEA）表明，使用廉价底物可以显著降低微生物脂质的生产成本（Soccol等人，2017年）。木质纤维素生物质（LCB）是最丰富且成本低廉的微生物脂质生产原料（Gao等人，2019年；Huang等人，2022年）。纤维素、半纤维素和木质素是LCB的主要成分（Remarks，2011年）。LCB水解物中含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等主要糖类（Chandel等人，2011年；Kim等人，2012年）。在高固体负荷下转化LCB具有重要意义（Zhang等人，2023年），因为它可以提高糖浓度和工艺效率（Tan等人，2020年），但同时会增加粘度和抑制剂的形成，给微生物发酵带来挑战（J?rgensen等人，2007年；Kamal等人，2024年）。

尽管进行了大量研究，但产油酵母的单一菌种培养系统仍然存在脂质产量低、生产力低和溶解氧限制等问题（Huang等人，2022年；Wang等人，2020年）。因此，开发经济高效且稳健的培养策略至关重要（Chen和Wan，2017年）。这些策略包括非无菌发酵（Chen和Wan，2017年）、高密度两阶段培养工艺（Yang等人，2014年）以及共培养以提高产量和生产力（Wu等人，2025年）。为了完成更复杂的任务，已经建立了同一物种或不同物种之间的多种微生物群落（Dürre等人，2016年；Nakayama等人，2011年；Zuck等人，2011年）。最近有报道指出，共培养系统可用于微生物脂质（Wu等人，2025年）、化学品（2-酮戊二酸、乳酸等）和天然产物（萜类、聚酮类、黄酮类、生物碱等）的生产（Bertrand等人，2014年；Eiteman等人，2009年；Sabra等人，2010年；Tsai等人，2010年；Wang等人，2016年）。在微生物脂质生产中，微藻与酵母共生，交换氧气、二氧化碳、营养物质、代谢物和副产物（Arora等人，2019a）。这种共生关系提高了整个过程的细胞质量和脂质生产力（Wu等人，2025年），其中酵母提供二氧化碳和有机酸，而藻类提供氧气，维持培养液的pH值和氧化还原平衡（Arora等人，2019a）。

同样，非无菌发酵是一种有前景的策略，可以消除传统的灭菌步骤，从而显著简化工艺并降低能耗（Li等人，2014年；Omeroglu等人，2024年）。虽然抗菌剂被用于控制污染（He等人，2025年），但它们会增加化学成本并引发环境问题。替代策略，如使用海水的卤碱ophilic条件，提供了更可持续的解决方案，避免了能源或化学密集型的灭菌过程（Chen和Jiang，2018年；Yu等人，2019年）。

下一代卤碱ophilic微生物脂质生产方法可以为燃料和油脂化工提供可持续且经济高效的生产途径，因为卤碱ophilic微生物能够在高盐度和碱性条件下茁壮成长（Chen和Jiang，2018年）。使用农业废弃物（Huang等人，2022年）和海水（Yu等人，2019年）等非传统原料，并减少化学物质的使用，可以显著降低生物炼制的成本和环境影响（Yu等人，2019年）。在营养限制和碳过剩的情况下，产油微生物能够有效积累脂质（Ratledge和Wynn，2002年）。采用多种培养策略可以促进产油微生物的高脂质积累。在单阶段培养过程中，微生物生长和脂质积累在同一营养和碳平衡的培养基条件下依次进行。在早期阶段，细胞迅速增殖，同时消耗生长限制营养物质；随后在中后期阶段，生物量形成减少，细胞内脂质积累增加（图S1，路径A）。相比之下，两阶段培养过程将细胞生长和脂质积累分开进行。首先在营养充足的条件下培养细胞以生成细胞生物量，然后将其转移到营养受限但碳丰富的培养基中以促进脂质生物合成（图S1，路径B）。早期研究证明了两阶段策略在连续和批次生产脂质方面的有效性（Hall和Ratledge，1977年）。在两阶段培养模式中，通常采用较高的初始细胞密度以缩短发酵时间，克服抑制剂对酵母代谢的影响并提高体积生产力（Guo和Olsson，2016年；Li等人，2007年）。两阶段策略也被证明对于从木质纤维素原料生产微生物脂质特别有效，因为这种策略需要良好的抑制剂耐受性和高效的碳转化（Gong等人，2013年）。

此外，也有许多关于微藻和酵母共培养系统用于脂质生产的报道（Arora等人，2019b），但大多数研究仅关注个别限制因素。相比之下，本研究提出了一种利用藻类Phaeodactylum tricornutum和酵母Cryptococcus curvatus的卤碱ophilic共培养系统，在基于海水的合成木质纤维素生物质（LCB）水解物上生产脂质，将多个工业相关因素整合到一个过程中。具体来说，该系统结合了单阶段和两阶段操作，采用非无菌的海水培养方式，并耐受LCB衍生的酚类抑制剂。这种综合方法进一步推动了下一代微生物脂质生物炼制技术的发展。

部分摘录

微生物、培养基和生长条件

实验中使用了酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509和微藻Phaeodactylum tricornutum Bohlin CCAP2561进行单培养和共培养。该酵母菌株来源于中国普通微生物菌种保藏中心。酵母菌株在28°C下于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）琼脂平板上活化，并在4°C下保存。YEPD琼脂培养基的组成如下（每升）：无水葡萄糖（20克）、琼脂（20克）、蛋白胨（10克）

结果与讨论

为了评估各种压力条件，实验流程设计如下：(i) 在两阶段脂质生产条件下优化藻类与酵母菌种的接种比；(ii) 评估不同工作体积下的操作条件；(iii) 评估非无菌、卤碱ophilic条件下的共培养系统的稳健性；(iv) 评估在合成LCB水解物上的单阶段共培养对混合糖转化和抑制剂耐受性的影响；以及(v)

结论

C. curvatus和P. tricornutum的两阶段共培养在各种盐度、pH值和抑制剂压力条件下显著提高了脂质产量。共培养所达到的高脂质浓度和产量表明，在工业相关限制条件下，两种菌株之间存在相互的代谢合作。即使在基于海水的非无菌、高盐度和碱性条件下，以及在抑制剂存在的情况下，共培养系统也表现出高度的稳健性

CRediT作者贡献声明

郝恒森：方法学研究、数据分析、正式分析。拉苏尔·卡马尔：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究、数据分析、概念化。罗佳熙：撰写 – 审稿与编辑、正式分析。易俊波：方法学研究。胡张莉：资源准备。王朝阳：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源获取、资金申请。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划合成生物学专项（2021YFA0910802）、深圳市科技项目（JCYJ20210324093604011）和广东省自然科学基金（2022A1515010285）的财政支持。