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微流控芯片集成电融合、化学发光免疫成像技术，实现高效单细胞杂交瘤筛选与抗体生产，融合效率达38%，单细胞抗体产量约3.0 pg，周期缩短至8天。
肖文成|白雅琪|敖航|刘星|吴杰|孙俊|吴妮琳|胡文瑞|陈云龙|廖彦健|胡宁|鞠黄贤
中国南京大学化学学院分析化学国家重点实验室，南京210023
摘要：
单克隆抗体（mAbs）的工业生产一直受到缺乏高效技术和设备的影响，这些技术和设备能够快速获得高产量的特异性杂交瘤细胞（HSHCs）。本研究介绍了一种高效的微流控装置，该装置集成了骨髓瘤细胞和淋巴细胞的单细胞配对与电融合、HSHCs的微流控化学发光免疫成像（μCLII）筛选、以及通过微流控控制和可编程信号发生模块实现HSHCs的选择性回收和增殖以分泌mAb。设计的带有泵的灯笼形阵列芯片通过泵控制的冲浪力实现了HSHCs的单细胞筛选和无损伤回收。以PCSK9-mAb为模型，该装置展示了38%的细胞融合效率，具有不对称的笼状结构，在2小时内精确分离出HSHCs，并在18小时培养后每个细胞可产生约3.0皮克的PCSK9-mAb。整个过程包括细胞融合和HSHCs的选择，可在8天内完成，这比商业技术的3-4个月大大缩短了生产周期，因此在单细胞分析、mAb筛选和药物发现等多个领域具有广泛应用前景。
引言
单克隆抗体（mAbs）在疾病诊断、治疗和生物医学研究中发挥着重要作用，但由于缺乏高效技术，其工业生产一直受到效率低、耗时长和劳动强度高的问题困扰（Di Cristina等人，2010；Van Lent等人，2021；Zhang等人，2020）。目前的杂交瘤技术是mAb生产的主流技术之一，但由于细胞融合和筛选方法效率低下，需要3-4个月才能获得高产量的特异性杂交瘤细胞（HSHCs）（Mazutis等人，2013；Wang等人，2024）。成熟的细胞融合方法包括病毒诱导融合（Zhang等人，2022）、聚乙二醇诱导融合（Karatekin和Rothman，2012）和电融合（Skelley等人，2009），但这些方法采用随机细胞配对，导致融合效率较低。此外，HSHCs的筛选主要依赖于基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的连续稀释法，需要长时间培养细胞以获得足够的分泌抗体用于ELISA检测（De Masi等人，2005；Zhang等人，2018）。因此，设计一种能够同时实现高效细胞融合和快速筛选HSHCs的集成设备对于提高mAb的工业生产具有重要意义。
微流控技术因其能够在局部微环境中高效处理单细胞而成为mAb生产的有前景的平台（Gao等人，2023；Huang等人，2022；Zhang等人，2020）。首先，微流控技术通过精确的微结构设计，能够方便地实现细胞配对和紧密的细胞间连接，从而有效促进细胞融合（Bai等人，2024a）。然而，骨髓瘤细胞和淋巴细胞体积差异较大，给细胞融合带来了挑战（Bai等人，2024b）。另一方面，微流控技术在细胞筛选领域也受到了广泛关注，因为它能够在皮升级别的空间限制内检测单个细胞分泌的mAb（Akbari和Pirbodaghi，2014；Bounab等人，2020；El Debs等人，2012；Eyer等人，2017；Gérard等人，2020；Abali等人，2019；Ansaryan等人，2023；Wang等人，2025）。基于液滴的方法利用连续流动的微体积液滴将单个杂交瘤细胞封装在液滴中，但由于细胞到达液滴形成位置的随机性，实际无法实现每个液滴中所有细胞的均匀封装（Collins等人，2015；Xu等人，2025）。基于微孔的方法通过重力将单细胞分离到微腔中，但这一过程主要受细胞大小的限制（Ogunniyi等人，2009）。基于微陷阱的方法的装载速率依赖于物理捕获结构和液体流动（Ahmadi等人，2024；Pang等人，2020）。同时，这些微流控方法在特定杂交瘤的实际筛选中也面临挑战，如复杂的异质免疫测定、清洗和添加试剂的难度以及需要专门的分子探针。均相化学发光（CL）免疫测定已被广泛用于敏感抗体检测（Ao等人，2022；Xiao和Xu，2020），因此非常适合用于微流控芯片上检测细胞分泌的极低浓度抗体。
本研究设计了一种不对称笼状芯片，用于体积差异较大的骨髓瘤细胞（B细胞）和淋巴细胞的配对和电融合。当向腔室中注入低渗透压的缓冲液时，这种结构可以限制细胞在膨胀过程中的移动或位移，从而实现两个细胞在单个腔室中的紧密接触，进而通过聚焦电场实现精确的电穿孔和细胞融合。设计的配对腔室结构和微流控电融合（μEF）方法保证了芯片上高通量细胞融合的稳定性。此外，通过高灵敏度的微流控CL免疫成像（μCLII）方法，可以快速准确地筛选HSHCs，并检测微腔室中单个细胞分泌的抗体。
从微腔室中收集选定的HSHCs采用了微操纵器吸移（Kobayashi等人，2022；Love等人，2006）和基于介电泳（DEP）力（Hata等人，2022）的技术。然而，微操纵器的低通量和物理损伤、DEP回收过程中的细胞损伤以及低释放效率限制了其实际应用。其他方法如脉冲紫外激光（Chen等人，2016）和光电子镊子（Breukers等人，2021；Kumar等人，2020）在收集选定细胞方面也存在一些缺点，尤其是对于半粘附和粘附细胞。在这里，我们在微腔室阵列下方组装了一个泵阵列，提供泵控制的冲浪力，以实现选定细胞的无损伤回收。通过集成μEF和μCLII芯片以及相应的细胞融合、筛选和回收方法、可编程信号发生器和综合软件模块，构建了一种高效的mAb生产装置。该集成装置实现了体积差异较大的细胞的38%电融合效率，在2小时内快速筛选出HSHCs，并在DMEM培养18小时后，每个增殖的HSHC可产生约3.0皮克的抗蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9单克隆抗体（PCSK9-mAb），显示出在特定细胞筛选和高纯度mAb生产中的广泛应用前景。
部分内容摘录
B细胞的制备
PCSK9肽免疫的BALB/c小鼠（FANTIBODY，中国）通过颈椎脱位处死，并按照重庆动物科学研究院机构动物护理和使用委员会批准的指南（许可证编号SYXK (Yu) 2022-0010）浸泡在75%酒精中。使用无菌剪刀和镊子分离脾脏，并将其浸泡在2 mL RPMI 1640溶液中。用注射器捣碎脾脏后，将脾细胞通过细胞过滤器过滤。设备的工作原理
该装置执行mAb生产的整个过程，从μEF芯片上骨髓瘤（SP2/0）细胞和B细胞的配对和电融合开始，到μCLII芯片上HSHCs的筛选和收集（图1），信号阈值通过统计分析各种特异性和非特异性分泌物的CL强度来确定。该设备的技术原理和功能模块的系统设计如图2A所示。其核心模块包括细胞电融合、CLII筛选和微流控控制。结论
为了解决获取HSHCs和mAb工业生产中高效技术和设备的缺乏问题，我们通过精心设计、测试、优化以及细胞电融合和筛选芯片的集成，开发了一种高效装置，实现了骨髓瘤细胞和淋巴细胞的配对和电融合，高度敏感的CLII检测单细胞分泌的抗体以进行细胞筛选，并无损伤地回收选定的HSHCs用于mAb生产。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。CRediT作者贡献声明
鞠黄贤：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。白雅琪：研究、数据分析、数据管理。敖航：数据分析。肖文成：撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念构思。孙俊：数据分析。吴妮琳：数据分析。刘星：数据管理。吴杰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、方法学。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。致谢
本研究得到了国家自然科学基金（21827812，22574076）和江苏省前沿技术研发计划（BF2024055）的支持。
