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低丰度miR-21高对比成像及药物筛选的熵驱动催化电路放大器构建。通过整合发夹结构燃料链与荧光DNA aptamer，有效抑制自发泄漏和背景信号，实现细胞内miR-21的高灵敏度特异性检测，并成功应用于抗癌药物动态监测。
李兰兰|卢颖|顾同年|马俊平|周远珍|余莎|朱俊杰
西安建筑科技大学化学与化学工程学院，中国西安，710055
摘要
传统荧光染料标记的熵驱动催化（EDC）电路的自发泄漏和持续活性严重影响了低丰度细胞内微RNA（miRNAs）分析的准确性。本文设计了一种基于发夹结构燃料驱动的荧光DNA适配体（HDFA）放大器，通过将发夹结构燃料链和荧光DNA适配体整合到EDC电路中，实现了活细胞中miRNA-21（miR-21）的高对比度成像。预锁定的燃料链有效抑制了非特异性链位移反应，而目标诱导的解锁恢复了燃料链的活性并启动了EDC电路的放大级联反应。同时，荧光DNA适配体介导的荧光染料激活确保了极低的背景信号，从而显著提高了信噪比和成像对比度。HDFA放大器的卓越灵敏度、特异性和稳定性使得能够检测活细胞中miR-21的表达差异，获得低背景和高视觉对比度的图像。此外，HDFA放大器还被用于监测MCF-7细胞在多种抗癌药物处理后的miR-21表达水平变化，展示了其在药物筛选应用中的实用性。因此，所提出的HDFA放大器为低丰度miRNAs的高对比度成像和癌症相关药物筛选提供了一个强大且多用途的平台。
引言
癌症的早期诊断和个性化治疗在很大程度上依赖于对肿瘤生物标志物的精确实时监测，这些标志物不仅反映了肿瘤的发生和发展过程，还为早期筛查、治疗评估和预后评估提供了重要信息（Zhou等人，2024；Jiang等人，2023）。微RNA-21（miR-21）在几乎所有实体瘤中都表现出高表达，使其成为癌症诊断和预后的通用生物标志物（Wang等人，2023；Xu等人，2024）。传统的基于分子信标的荧光原位成像策略完全依赖于直接的探针-目标杂交，缺乏内在的信号放大能力，不足以检测复杂细胞环境中的低丰度生物标志物（Feng等人，2023；Yin等人，2012）。相比之下，新兴的核酸等温扩增策略，特别是无酶扩增策略，如杂交链反应（HCR）（Zhang等人，2025；Shen等人，2023）、催化发夹组装（CHA）（Wang等人，2024；Han等人，2024）和熵驱动催化（EDC）电路（Qian等人，2024；Yu等人，2022），能够在温和条件下实现强大的信号放大，无需依赖复杂的仪器设备，从而为精确高效的生物标志物分析开辟了新的机会。其中，EDC电路主要由稳定的双链DNA和燃料链组成，通过系统熵的增加来驱动，并在整个反应过程中保持碱基对总数的恒定，从而显著提高了扩增效率、稳定性和特异性（Kang等人，2022；Xu等人，2025）。尽管基于EDC的扩增策略已广泛用于活细胞中微RNA（miRNAs）的原位分析，但仍存在两个不可避免的挑战：（i）熵驱动的链位移事件可能在目标未激活的情况下自发发生，这是EDC电路中背景泄漏的主要原因（Yu等人，2025；He等人，2022）；（ii）大多数传统荧光染料标记的探针具有持续活性，导致背景信号升高和检测准确性降低（Liu等人，2025；Li等人，2025）。
已经提出了一些缓解EDC电路中自发链位移的策略。最简单的策略是降低EDC组分的共存浓度，这可以有效减少非特异性杂交和背景泄漏，但这种方法通常会牺牲反应动力学和信号强度（Clowsley等人，2021）。微调 foothold区域的长度和碱基组成可以抑制非目标依赖的链位移，然而这种策略依赖于特定序列，缺乏普遍适用性（Liu等人，2024）。此外，虽然引入阈值门控结构或级联逻辑电路可以显著提高特异性，但这些设计不可避免地增加了系统复杂性和实验负担（Deng等人，2024）。与传统线性探针相比，发夹结构探针通常由互补的茎区和环区组成，具有简单的结构却表现出高功能，由于其独特的空间构象和可编程设计而具有显著优势（Xu等人，2016）。封闭的茎区构象有效地保护了活性识别位点，从而防止非特异性杂交和自发反应，显著降低了背景信号（Liu等人，2025；He等人，2023）。此外，环区可以灵活设计以包含特定的识别序列，实现精确的目标识别（Liu等人，2026）。目标结合时，发夹会发生构象转变，导致茎区打开并暴露活性位点，从而启动后续反应。因此，我们认为将燃料链与发夹结构整合到EDC电路中可以使发夹保持封闭构象，有效降低目标缺失时的活性燃料链浓度，从而抑制自发链位移和背景泄漏。而在目标存在时，发夹会解锁，恢复燃料链的活性并启动EDC放大。这种机制增强了EDC电路的动态调节和信号控制能力，确保了高灵敏度，同时保持了出色的特异性和有利的信噪比。
此外，传统荧光染料标记探针的固有荧光背景是另一个主要的干扰源。因此，开发新的荧光染料激活机制对于有效抑制背景信号至关重要。最近，荧光适配体——能够在选择性结合非荧光小分子染料时产生强烈荧光的特定DNA或RNA链，在低背景和高对比度的细胞内RNA成像中引起了广泛关注（Yin等人，2023；Ebrahimi等人，2021）。尽管荧光RNA适配体，特别是与核酸扩增策略结合使用时，能够同时提高扩增效率和成像灵敏度，但由于RNA在普遍存在的RNases存在下的易降解性，其在复杂生物样本中的应用受到限制（Yan等人，2025；Doherty等人，2024）。相比之下，新出现的荧光DNA适配体表现出更好的化学稳定性、更大的设计灵活性和更长的细胞内半衰期，这增强了它们对核酸酶降解的抵抗力，使其特别适合细胞内成像和长期监测应用（Wu等人，2025；Chen等人，2024）。此外，荧光DNA适配体可编程的二级结构和高度的构象可控性使其能够与非荧光小分子染料形成特定且稳定的复合物，从而提高荧光强度并减少背景干扰（Zhang等人，2025）。当前的研究表明，荧光DNA适配体对于相应的非荧光小分子染料表现出更高的选择性、更好的信噪比和更强的稳定性（Wu等人，2025；VarnBuhler等人，2022）。
在这里，我们通过将发夹结构燃料链和荧光DNA适配体整合到EDC电路中，开发了一种基于发夹结构燃料驱动的荧光DNA适配体（HDFA）放大器，用于活细胞中miR-21的高对比度成像。燃料链的发夹配置有效抑制了由自发反应产生的背景信号，同时保持了EDC电路的扩增效率。同时，荧光DNA适配体确保初始荧光信号几乎无法检测到，从而显著提高了信噪比和成像对比度。因此，荧光DNA适配体介导的荧光激活与发夹结构燃料驱动的EDC扩增的协同整合，实现了活细胞中miR-21的低背景和高对比度成像，这对于敏感可靠的低丰度miRNAs分析具有巨大潜力。
HDFA放大器负载的MnO2纳米片的制备
MnO2纳米片是根据先前报道的方法合成的，并进行了轻微修改（见支持信息）。由于DNA与MnO2表面之间的范德华力和π-π相互作用，HDFA放大器可以稳定地固定在MnO2纳米片上。HDFA放大器由发夹结构燃料链（H）和含有荧光DNA适配体（S/C/FA）的三组分DNA杂交体组成。荧光DNA适配体（FA）的核苷酸序列来自
发夹结构燃料驱动的荧光DNA适配体放大器原理
如图1A所示，设计的发夹结构燃料驱动的荧光DNA适配体（HDFA）放大器由含有荧光DNA适配体（S/C/FA，记为TD）和发夹结构燃料链（H）的三链杂交体构成。为了实现高效稳定的细胞内递送，HDFA放大器随后通过DNA与MnO2纳米片之间的范德华力和π-π相互作用的协同效应被加载到谷胱甘肽（GSH）可降解的MnO2纳米片上
结论
总之，通过将发夹结构燃料驱动的EDC电路与荧光DNA适配体协同整合，构建了一种HDFA放大器，可以有效克服传统荧光染料标记EDC电路中存在的严重自发反应和高背景荧光信号的局限性，从而提高了miR-21检测的灵敏度和准确性。此外，在MnO2纳米片介导的高效
CRediT作者贡献声明
马俊平：可视化，资金获取。顾同年：验证，资源提供。卢颖：正式分析，数据管理。李兰兰：撰写——初稿，正式分析，数据管理，概念化。朱俊杰：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理。余莎：撰写——审阅与编辑，资金获取，正式分析，概念化。周远珍：监督，资金获取
未引用参考文献
Liu等人，2025；Zhang等人，2025。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（22104118、22274125、22504109）、陕西省科学技术协会的青年人才支持项目（20240619）、陕西省高层次人才引进计划的青年科学家项目，以及西安建筑科技大学的跨学科研究培养项目的财政支持。我们还要感谢西安仪器分析中心的Dang Jiaoe博士和Huang Wenlong
