一种用于实时可视化及早期评估乳腺癌中对CDK4/6抑制剂反应的NIR-Ⅱ荧光探针

《Cancer Letters》：A NIR-Ⅱ Fluorescent Probe for Real-Time Visualization and Early Assessment of Responses to CDK4/6 Inhibitors in Breast Cancer

基于CDK4/6抑制剂的近红外荧光探针HSA-ICi开发成功，可非侵入性监测肿瘤内CDK4/6活性变化，早期（治疗一周）通过荧光信号下降反映药物响应，并区分敏感/耐药肿瘤，为精准调整内分泌联合治疗提供工具。

　　

高一阳|楼康良|林琳琳|李成曦|林胜杰|陈一鑫|陈洪宇|白静文|张国军

中国厦门大学医学院翔安医院乳腺癌精准诊断与治疗福建省重点实验室及内分泌相关癌症精准医学厦门重点实验室，厦门361101

摘要

目前，对激素受体阳性（HR+）、HER2阴性（HER2-）乳腺癌患者使用环素依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂的治疗反应评估主要依赖于解剖成像技术，但该技术存在显著的时间延迟。为了实现药物活性的早期和直接可视化，我们开发了一种近红外-II（NIR-II）荧光分子探针HSA-ICi，该方法通过将CDK4/6抑制剂（帕博西利布或利博西利布）与ICG结合，并促进其与人血清白蛋白的自组装来实现。该探针在临床前模型中表现出对CDK4/6-细胞周期蛋白D复合物的特异性靶向、优异的生物相容性以及高肿瘤积聚能力。关键的是，HSA-ICi能够无创地监测药效反应：在治疗后一周内，通过NIR-II成像即可检测到肿瘤荧光信号的显著下降，这一变化早于通过卡尺或磁共振成像（MRI）检测到的肿瘤体积变化。这种早期信号减弱与肿瘤组织中pRB和Ki-67表达的降低相关。此外，该探针能够区分对CDK4/6抑制剂敏感和耐药的肿瘤，耐药模型显示出持续的低基线信号。我们的发现表明HSA-ICi是一种有前景的工具，可用于早期评估治疗效果和识别耐药性，从而可能有助于及时调整HR+/HER2-乳腺癌患者的治疗方案。

引言

激素受体阳性（HR+）、人表皮生长因子受体2阴性（HER2-）乳腺癌约占所有乳腺癌病例的70%（1）。在环素依赖性激酶4/6（CDK4/6）抑制剂出现之前，内分泌疗法和化疗是这种亚型的主要治疗手段<2, 3>。随着PALOMA-1试验（4）的结果，帕博西利布于2015年被批准作为首个用于HR+/HER2-局部晚期或转移性乳腺癌的CDK4/6抑制剂。随着帕博西利布及其后续同类抑制剂（如阿贝西利布、利博西利布和达尔西利布<5, 6, 7, 8, 9>）的特异性、选择性和毒性谱的改善，患者的生存率和临床效果显著提高。如今，多项全球临床试验已将CDK4/6抑制剂与内分泌疗法联合使用作为早期高风险复发和晚期或转移性乳腺癌患者的标准治疗方案<10, 11, 12, 13>。

然而，大约10%的患者对CDK4/6抑制剂具有内在耐药性，因此从这种治疗方式中获得的临床益处有限<14>。即使在初始响应的患者中，也有相当一部分最终会发展出获得性耐药性并导致疾病进展<14>。缺乏可靠的方法来识别潜在响应者和早期耐药性，成为HR+/HER2-乳腺癌精准医疗实施的主要障碍<15, 16, 17>。目前，临床试验和常规实践中的疗效评估主要依赖于RECIST 1.1等解剖成像标准，这些标准只能检测肿瘤大小的变化<18>。这种方法存在固有的时间延迟——通常需要治疗两个月或更长时间才能进行可靠的评估——并且无法捕捉到早期的分子反应或预测内在或获得性耐药性<19>。因此，患者可能会长时间接受无效的治疗，承受不必要的毒性，并延迟转向替代疗法。

为了解决这一难题，已经探索了几种分子成像策略<20>。例如，有一项研究使用雌激素受体靶向示踪剂¹⁸F-FES，发现其摄取和异质性可以预测帕博西利布与内分泌疗法联合使用的疗效<21>。然而，这是一项回顾性分析，未能建立与CDK4/6通路活性的直接联系或验证该方法用于长期治疗监测的可行性。其他研究小组合成了放射性标记的CDK4/6抑制剂，如⁶⁸Ga-DOTA-Palbociclib²²和¹⁸F-Palbociclib²³，这些抑制剂在肿瘤中显示出特异性摄取，并且这种摄取可以被母体药物阻断，从而证实了靶点的结合。这些研究强调了将CDK4/6抑制剂与成像部分结合可以产生高靶向特异性的探针。尽管如此，它们在直接、重复评估治疗效果方面的潜力——尤其是在早期反应监测和耐药性识别方面——尚未得到充分探索。在之前的研究中，我们建立了一种使用脂质体包裹的生物传感器肽进行体内CDK4/6激酶活性的荧光成像方法24。这种方法能够在治疗开始后一周内监测到CDK4/6抑制剂的疗效。然而，在可见光范围内操作限制了组织的穿透性和空间分辨率，且探针配方的复杂性阻碍了临床应用。

在本研究中，我们尝试开发了一种新型近红外-II（NIR-II）荧光探针（HSA-ICi），该探针包含ICG-CDK4/6抑制剂缀合物（ICi）和人血清白蛋白（HSA），以实现体内CDK4/6激酶活性的无创、实时监测。这一工具旨在帮助识别对CDK4/6抑制有响应和无响应的患者。

HSA-ICi的制备与表征

高效液相色谱（HPLC）证实了ICi的成功合成——即IP（ICG-帕博西利布缀合物）和IR（ICG-利博西利布缀合物）。合成效率很高，IP的产率为93.17%，IR的产率为95.70%。帕博西利布（或利博西利布）、ICG-NHS及其相应缀合物IP（或IR）的独特保留时间和特征峰证实了成功的 conjugation（图1B和补充图S1A）。质谱（MS）

讨论

在本研究中，我们开发了一种基于CDK4/6抑制剂的NIR-II荧光探针HSA-ICi。我们的发现表明，该探针对CDK4/6-细胞周期蛋白D复合物具有特异性靶向亲和力，并能有效地在活体系统中可视化CDK4/6激酶活性。此外，它还显示出良好的肿瘤靶向效果，并能够在体内在一周内准确评估CDK4/6抑制剂单药治疗和CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的疗效。

研究人员一直在探索

ICi的合成

CDK4/6抑制剂（帕博西利布或利博西利布，MedChemExpress）在60°C下用二甲基亚砜（DMSO，Aladdin）溶解，并以1000 rpm的速度搅拌。使用冰醋酸（Aladdin）将溶液pH值调整至8.0。然后以1:2的摩尔比加入ICG-NHS酯（J&K Scientific）。反应混合物在37°C下避光搅拌4小时。产物IP和IR通过HPLC（LC20-AD，Shimadzu）在梯度洗脱条件下进行纯化

CRediT作者贡献声明

李成曦：方法学。林琳琳：方法学。陈一鑫：数据整理。林胜杰：数据整理。高一阳：撰写——初稿、可视化、实验研究。楼康良：方法学。白静文：撰写——审稿与编辑、资金争取。陈洪宇：数据分析。张国军：撰写——审稿与编辑、概念构思

未引用的参考文献

33..

伦理批准与参与同意

动物实验遵循相关指南进行，并获得了厦门大学动物护理和使用委员会的批准（伦理批准号：XMULAC20180037）。实验所用雌性BALB/c裸鼠年龄为6-8周，由同一委员会提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突

数据和材料获取

所有数据均可在正文或补充材料中找到。本研究生成的所有原始数据可向相应作者索取。

资助

云南省科技厅社会发展关键研究与发展计划（编号202403AC100014）

国家自然科学基金（编号32171363和82560355）

云南癌症分子成像国际联合实验室（编号202503AP140032）

云南Jie Tian专家工作站（编号202505AF350067）

云南临床医学中心研究项目（编号2024YNLCYXZX0418）

第三附属医院的横向项目资助

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

不适用