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抗氧化多糖接枝：酶催化法合成Pull-FA并研究其结构与抗氧化活性。采用漆酶催化木犀草酚（FA）接枝中性真菌多糖Pullulan，最高接枝率达8.8%。通过13C固态核磁共振、MALDI-TOF质谱证实接枝为单脱羧木犀草酚二聚体（β-5），并揭示分子自组装特性随接枝率变化。动态光散射和流变学分析表明稀溶液中存在疏水自组装，浓溶液中形成可逆凝胶。DPPH自由基清除实验显示抗氧化活性随接枝率线性增强。该绿色合成方法避免了传统化学活化剂和溶剂，为功能化多糖开发提供新途径。
Koceila BOUNDAOUI | Xavier FALOURD | Corinne LOUTELIER-BOURHIS | Tony VARACAVOUDIN | Luc PICTON | Didier LE CERF | Virginie DULONG
鲁昂诺曼底大学，鲁昂诺曼底INSA，CNRS，PBS UMR 6270，法国鲁昂，邮编76000
摘要
通过一种创新的、环保的酶促反应合成了抗氧化多糖，该反应催化了阿魏酸（FA）接枝到普鲁兰（Pullulan）上。成功合成了多种纯度经过验证的Pull-FA产品，最大实验接枝率（GR）达到了8.8%，这是通过Folin Ciocalteu方法测定的。首次利用13C固态核磁共振（NMR）和MALDI-TOF质谱（MS）分析了接枝产物的化学结构，结果表明接枝的是一种带负电荷的单脱羧阿魏酸二聚体（β-5）。通过尺寸排阻色谱（SEC）/多角光散射（MALS）/动态光散射（DRI）/紫外光谱（UV）/粘度测量（visco）分析证实了接枝现象，并发现这种自组装行为依赖于接枝率。利用尼罗红荧光探针和光散射技术研究了稀释介质中Pull-FA的聚集能力与接枝率和介质pH值的关系。在半稀释/浓缩介质中，由于pH条件的变化，接枝产物表现出可逆的物理凝胶行为。DPPH•分析显示了Pull-FA的抗氧化活性，并证实了EC50值随接枝率的线性降低。
引言
多糖的改性是近年来发展迅速的科学领域之一。为了适应不同应用的需求，对其性能和功能的改进极大地促进了相关研究。将具有特定功能的分子接枝到多糖上可以制备出高附加值的衍生物。酚类化合物因其天然丰度和抗氧化、抗菌、抗癌等特性而被广泛用于多糖的改性（Albuquerque等人，2021；De la Rosa等人，2019）。此外，研究发现酚类化合物在自然界中并非总是以游离形式存在，有些还天然地结合在多糖上，例如阿魏酸（FA）会接枝到阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan）（Carvajal-Millan等人，2005）和甜菜果胶（Saulnier & Thibault，1999）上。因此，仿生地将酚类化合物接枝到多糖上的方法也显著提升了该领域的研究兴趣。
文献中描述了多种酚类化合物与多糖的化学接枝实例，如阿魏酸接枝到纤维素（Trombino等人，2008，2009）、羧甲基普鲁兰（CMP）（Dulong等人，2016）和普鲁兰（Pull）（Hadrich等人，2020）、没食子酸接枝到壳聚糖（Pasanphan等人，2010）以及氨基胍接枝到CMP（Kouassi等人，2017）。结果表明，经过改性的多糖具有抗氧化（Hadrich等人，2020；Pasanphan等人，2010；Trombino等人，2008，2009）和抗菌（Kouassi等人，2017）性能。然而，这些反应通常需要使用化学活化剂、有机溶剂和苛刻的反应条件，这已成为其主要缺点。相比之下，酶催化技术能够克服传统化学方法的局限性（Boundaoui等人，2024）。酶催化不仅环保，而且具有高度的原子经济性，无需外部活化剂或极端反应条件（Koeller & Wong，2001）。基于这些特点，人们开发了多种酶法将酚类化合物接枝到多糖上的方法。专用于酚类化合物的氧化还原酶能够特异性地识别并氧化它们，生成活性分子（醌）或自由基形式（半醌），从而与多糖发生反应。尽管酚类化合物与多糖的接枝机制尚不完全清楚，但已有多种假说提出，涉及Schiff碱反应和Michael加成反应等途径（Bo?i?等人，2012a；Brzonova等人，2011；Díaz Blanco等人，2009；Huber等人，2017）。
由于壳聚糖胺基团的反应活性，许多研究聚焦于利用氧化还原酶将其催化酚类化合物接枝到壳聚糖上（Boundaoui等人，2024）。Bozic等人（Bo?i?等人，2012a；Bo?i?等人，2012b；Bo?i?等人，2013）和Aljawish等人（Aljawish等人，2012；Aljawish等人，2014；Aljawish等人，2016）的研究推动了这一酶促改性技术的发展。属于氧化还原酶家族的漆酶（EC 1.10.3.2）被用于将没食子酸、咖啡酸（Bo?i?, Gorgieva和Kokol，2012b；Bo?i?, ?trancar和Kokol，2013）、阿魏酸和乙基阿魏酸（Aljawish等人，2012；Aljawish等人，2014；Aljawish等人，2016）接枝到壳聚糖上。通过比色法测得阿魏酸的接枝率为41.4 mg.g?1，乙基阿魏酸的接枝率为22.8 mg.g?1（Aljawish等人，2016）。此外，还研究了没食子酸（Li等人，2021）和槲皮素（Yong等人，2022）在壳聚糖上的接枝率。酚类化合物接枝到阴离子多糖（如果胶（Karaki等人，2016；Karaki等人，2017）和阿拉伯树胶（Vuillemin等人，2020；Vuillemin等人，2021）上的情况也很普遍。例如，阿魏酸在果胶上的接枝率为54.7 mg.g?1（Karaki等人，2016；Karaki等人，2017），在阿拉伯树胶上的接枝率为86.2 mg.g?1（Vuillemin等人，2020；Vuillemin等人，2021）。相比之下，酚类化合物接枝到中性多糖上的研究较少。据我们所知，仅报道了儿茶素（Vittorio等人，2016）在右旋糖酐上的接枝率为128 mg.g?1，苯氧二醇（Yee等人，2019）在右旋糖酐上的接枝率为3.25 mg.g?1，姜黄素（Curcio等人，2020）在葡聚糖上的接枝率为23.9 mg.g?1，阿魏酸在葡聚糖上的接枝率为6 mg.g?1（Xiao等人，2023），以及阿魏酸在纤维素上的接枝量为3.2%（Morin等人，2019）。尽管如此，这些研究大多未深入探讨接枝产物的纯度、接枝键的性质、结构、大分子特性和物理化学行为（Boundaoui等人，2024）。此外，所进行的分析通常不如多糖化学改性研究那么全面。
在这项工作中，我们研究了阿魏酸（FA）接枝到中性真菌外多糖普鲁兰（Pull）上的过程（图1）。选择阿魏酸是因为它是羟基肉桂酸最常见的衍生物，并且具有多种有趣的生物活性，尤其是抗氧化作用。普鲁兰是一种聚(α-1,6-麦芽三糖)，其中性线性结构使其具有高水溶性、良好的柔韧性以及低粘度。由于其无毒、无致突变性和无致癌性，普鲁兰被归类为“一般认为安全”（GRAS）的生物聚合物，广泛应用于制药、化妆品和食品行业（De Souza等人，2023；Singh等人，2023）。为普鲁兰添加抗氧化性能可以进一步提升其在这些领域的应用价值，尤其是在制药领域，例如通过黄芪多糖保护肠道屏障（Su等人，2023）。此前，我们的团队已经通过化学方法（咪唑化学）实现了阿魏酸在普鲁兰上的接枝（Hadrich等人，2020）。通过比较化学方法和酶法得到的结果，可以更好地理解这一过程。选择来自Myceliophthora thermophila的漆酶，是因为其商业可用性、高活性以及在中性pH下的稳定性（Bebi?等人，2020）。这类漆酶已被广泛用于多糖的酚类化合物改性研究（Aljawish等人，2016；Huber等人，2017；Karaki等人，2017；Kim等人，2017；Liu等人，2018）。产物结构通过Folin-Ciocalteu测定、紫外光谱（UV）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、ζ电位、1H溶液态核磁共振（NMR）和13C固态NMR进行表征。此外，通过基质辅助激光解吸-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析了特定的Pull-FA水解产物。产品的分子量和构象特性通过尺寸排阻色谱（SEC）结合多角光散射（MALS）、差示折射率检测器（DRI）、280 nm紫外检测器和粘度计进行测定。在稀释介质中利用尼罗红荧光探针和动态光散射研究了产品的自组装行为，在半稀释缠结介质中通过流变学进行了研究。最后，通过2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH•）比色法评估了试剂和产物的抗氧化活性。
材料
普鲁兰（Pull）由日本Hayashibara Biochemical Laboratory提供。阿魏酸（FA）、麦芽三糖（Malto）和硝酸锂（LiNO3）从法国Acros Organics购买。漆酶（EC 1.10.3.2）来自Myceliophthora thermophila，普鲁兰酶（EC 3.2.1.41, P1067）来自Klebsiella pneumoniae，Folin-Ciocalteu试剂、2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH•）、尼罗红、磷酸二钠二水合物（Na2HPO4·2 H2O）和盐酸（HCl）也均从相应供应商购买。
初步实验：Pull-FA酶促合成的概念验证
使用来自Myceliophthora thermophila的漆酶通过酶促催化将阿魏酸（FA）接枝到普鲁兰（Pull）上，接枝率（GRT）范围为10%至100%，实验方案参考了现有文献（Aljawish等人，2012；Aljawish等人，2014；Aljawish等人，2016；Bo?i?, Gorgieva和Kokol，2012a；Bo?i?, Gorgieva和Kokol，2012b；Bo?i?, ?trancar和Kokol，2013）。同时，在无漆酶的情况下也进行了空白实验，接枝率为60%。在纯化步骤中，我们首先进行了...
讨论
所有Pull-FA的结构分析均证实了接枝产物中同时含有普鲁兰和阿魏酸。然而，即使对于简单的模型反应（Malto-FA），接枝阿魏酸的结构分析也非常复杂。通过MALDI-TOF分析水解后的Pull-FA-7.8%样品，推测形成了阿魏酸二聚体。这种二聚体可能是由漆酶氧化后的阿魏酸发生二聚反应后脱羧形成的（图6）。
结论
利用创新的环保接枝反应成功实现了阿魏酸在普鲁兰上的酶促接枝。通过Myceliophthora thermophila的漆酶一锅法催化反应，获得了多种纯度的Pull-FA产品。根据酚类敏感的Folin-Ciocalteu测定，阿魏酸在普鲁兰上的接枝率范围为4%至8.8%（最高达到95.8 mg.g?1）。经典结构分析证实了阿魏酸在普鲁兰上的存在，并显示了其与接枝基团的定量关系。
CRediT作者贡献声明
Koceila BOUNDAOUI：撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析、概念构建。
Xavier FALOURD：撰写、审稿与编辑、数据分析。
Corinne LOUTELIER-BOURHIS：撰写、审稿与编辑、数据分析。
Tony VARACAVOUDIN：数据分析。
Luc PICTON：方法设计、实验实施。
Didier LE CERF：撰写、审稿与编辑、结果验证、项目监督、方法设计、实验实施、资金申请、概念构建。
Virginie DULONG：
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
感谢法国“高等教育、研究与创新部”对Koceila BOUNDAOUI的财政支持。同时感谢“诺曼底大区”和欧盟在设备采购方面的资助。
