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本研究探讨了氯吡草酮（CPF）慢性暴露对日本鲈鱼（Oryzias latipes）行为、发声特征及脑转录组的影响。结果显示，CPF显著降低探索行为和社会互动，改变发声参数，抑制眼部乙酰胆碱酯酶活性，并鉴定到68和1014个差异基因，涉及心脏收缩和肾上腺素信号通路，提示CPF可能通过干扰肌肉功能和神经内分泌系统影响发声行为，对生态安全具有潜在风险。
Xuchun Qiu|Ying Wu|Yue Liu|Mengcheng Zhuo|Kun Chen|Yuki Takai|IkJoon Kang|Yohei Shimasaki|Yuji Oshima
江苏大学环境与安全工程学院，镇江重点实验室，中国镇江212013
摘要：
氯吡硫磷（CPF）是一种广泛使用的有机磷农药，其污染可能对水生生物构成潜在风险。然而，关于长期接触CPF对发声鱼类声学交流的影响仍缺乏相关研究。在本研究中，我们探讨了CPF（浓度分别为0、0.3和3.0 μg/L）在21天内的暴露对日本青鳉（Oryzias latipes）的运动行为、发声特征及大脑转录组的影响。结果表明，CPF暴露显著降低了青鳉的探索行为和社会互动能力，并改变了其发声特征。此外，CPF还显著抑制了青鳉眼睛中的乙酰胆碱酯酶活性。转录组分析显示，在0.3 μg/L和3.0 μg/L的暴露条件下，分别有68个和1014个基因发生差异表达（DEGs）：0.3 μg/L组有38个基因上调，30个基因下调；3.0 μg/L组有455个基因上调，559个基因下调。两组差异表达基因均富集在与心肌收缩和心肌细胞肾上腺素能信号传导相关的通路中，这表明CPF可能影响鱼类肌肉功能，从而改变其发声特征。此外，3.0 μg/L的CPF暴露还破坏了与神经系统和内分泌系统相关的多个关键生物通路，为CPF引起的行为和发声障碍提供了机制上的解释。鉴于声学信号在鱼类生存和繁殖成功中的关键作用，进一步研究CPF对发声鱼类声学信号的影响至关重要。
引言
作为典型的有机磷农药，氯吡硫磷（CPF）通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性导致突触中乙酰胆碱（Ach）的积累[1]。由于长期和广泛的应用，CPF残留物已在多种水环境中被检测到[2]、[3]、[4]，其浓度通常在ng/L到几μg/L之间[3]。例如，在孟加拉国Baitkamari Beel地区，雨季CPF的最大浓度达到3.1 μg/L[2]；在Savar Upazila的农业区附近，地表水中的CPF浓度为3.27 μg/L[4]。
研究表明，CPF暴露会对水生生物产生负面影响，导致氧化应激和细胞凋亡[5]、神经毒性[6]、基因毒性[7]以及行为异常[8]、[9]、[10]、[11]。例如，350 μg/L的CPF暴露持续5周后，成年斑马鱼的运动行为、社交接近行为、惊吓反应和躲避捕食者的能力均受到影响[10]。在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中，5-25 μg/L的CPF暴露会显著降低其摄食率并抑制生长[11]。由于鱼类行为对其身体维持、摄食和躲避捕食者至关重要，CPF暴露引起的行为异常可能对鱼类种群和水生生态系统构成严重威胁[12]、[13]、[14]、[15]。此外，多项先前的研究还表明CPF可能显著影响哺乳动物和鸟类的发声交流。例如，出生后第1-4天通过皮下注射给予0.1、0.3和1.0 mg/kg体重的CPF，会显著降低大鼠幼崽的超声波发声频率[16]；而口服给予9和12 mg/kg体重的CPF（持续15天）会降低雄性日本鹌鹑（Coturnix japonica）的鸣叫频率[17]。对于水生物种，10-700 μg/L的CPF暴露会导致蝌蚪的发声持续时间缩短、脉冲次数减少以及主导频率升高，这种效应在长期暴露时更为明显[18]。急性CPF暴露（浓度为30、60和120 μg/L）也会显著改变日本青鳉（Oryzias latipes）的发声行为，而日本青鳉是一种常用的毒性测试模型生物[20]、[21]。
发声交流对动物具有至关重要的作用，可用于寻找保护、定位和求偶等目的[22]、[23]、[24]。因此，任何影响鱼类检测或响应生物重要声音能力的因素都可能对其个体和种群的生存与健康产生负面影响[23]、[24]、[25]、[26]。然而，关于长期CPF暴露对鱼类发声特征及其潜在机制的影响仍知之甚少。本研究考察了CPF暴露对日本青鳉的运动行为、发声特征以及大脑和眼睛中AChE活性的影响，并分析了这些因素之间的关联。此外，还利用RNA测序（RNA-Seq）技术揭示了CPF暴露引起的行为异常的分子基础。
试剂
氯吡硫磷（CPF；CAS：2921-88-2），纯度为99%，购自上海Aladdin生化科技有限公司（中国上海）。二甲基亚砜（DMSO）由上海新华制药试剂有限公司提供。基于ELISA的CPF浓度检测试剂盒购自江苏智慧科技发展有限公司（中国江苏）。
实验鱼
实验用日本青鳉（6个月大；体重0.13 ± 0.04克）来自江苏水生毒理学实验室
结果
实际测得的CPF浓度分别为0.26 ± 0.06 μg/L（0.3 μg/L组）和2.73 ± 0.41 μg/L（3.0 μg/L组）。在整个暴露测试过程中未观察到死亡现象。讨论
我们的结果表明，即使在环境相关浓度下，CPF也能显著改变日本青鳉的发声行为，同时伴随着探索行为和社会互动能力的下降。多项先前的研究已证实，暴露于CPF的水生生物的运动行为会出现异常[15]。例如，McCllland和Woodley[31]报告称，10 μg/L的CPF会增加北方豹蛙的探索行为。结论
总体而言，本研究首次证明，即使在环境相关浓度下，CPF也能显著改变日本青鳉的发声特征。大脑样本的转录组分析显示，CPF暴露破坏了与循环系统、神经系统和内分泌系统相关的多个关键生物通路，为CPF引起的行为和发声障碍提供了机制上的解释。鉴于发声信号在鱼类生存和繁殖中的关键作用，这一发现具有重要意义。作者贡献声明
Yuji Oshima：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计。
Ying Wu：撰写 – 初稿撰写、数据可视化、实验设计、数据管理。
Xuchun Qiu：撰写 – 审稿与编辑、实验监督、方法学设计、资金申请。
Yuki Takai：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、方法学设计。
Kun Chen：撰写 – 审稿与编辑、实验设计、数据分析。
Mengcheng Zhuo：数据可视化、实验设计、数据管理。
Yue Liu：撰写 – 初稿撰写、实验设计、数据管理。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32071623和32571900）以及镇江药物疗效与健康风险评估重点实验室（SS2024006）的支持。
