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本研究通过多组学分析揭示 Seneciphylline（Spe）诱导小鼠原代肝细胞线粒体功能障碍的机制，发现 Spe 抑制三羧酸循环并激活凋亡通路。首次建立基于PBPK模型的逆向剂量学方法，成功预测体内肝毒性阈值，为天然毒素风险评估提供新方法。
陆宇顺|马江|耿远|张冰雁|丁峥|史晓莉|徐艳阳|邱静|钱永忠|史文彪|陈璐
中国农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所农产品质量安全重点实验室，北京，100081，中国
摘要
Seneciphylline（Spe）是一种高肝毒性的吡咯里西啶生物碱（PAs），存在于药用植物中，对人类健康构成风险，但其风险评估受到缺乏足够的体内毒性数据的限制。本研究结合了小鼠原代肝细胞的多组学分析和体内验证，阐明了Spe的肝毒性机制，并建立了一种基于生理学的药代动力学（PBPK）建模辅助的反向剂量学预测框架。结果表明，Spe导致线粒体膜电位（MMP）和ATP水平下降，进而干扰了小鼠原代肝细胞中的三羧酸（TCA）循环代谢。关键的TCA循环代谢物，包括顺式-aconitate、苹果酸、NAD+和NADH，显著增加。Spe暴露改变了小鼠原代肝细胞和肝组织中的P53信号通路，并调节了凋亡通路，同时PMAIP1和SEPTIN4的基因和蛋白质表达水平升高，以及细胞色素c（Cyt c）和Caspase9（CASP9）的蛋白质表达也增加。P53可以诱导促凋亡蛋白BAX和PMAIP1的转录，从而促进线粒体膜通透性和细胞色素c的释放，最终激活凋亡通路，导致小鼠肝脏损伤。此外，我们首次利用PBPK建模辅助的反向剂量学方法，将Spe的体外线粒体毒性数据外推到体内预测中。PBPK预测的肝脏毒性阈值与体内毒性数据非常吻合。总体而言，本研究揭示了Spe诱导肝毒性的机制基础，并建立了一种基于PBPK的反向剂量学方法，用于非动物依赖性的天然毒素预测。
引言
吡咯里西啶生物碱（PAs）是一类主要产生于开花植物的天然毒素。PA暴露可导致人类健康问题，包括肝窦状梗阻综合征甚至癌症[1]。全球已报告超过17,000例与摄入含PA的草药产品相关的急性肝中毒病例[2]。已鉴定出660多种PA及相关N-氧化物，其中Seneciphylline（Spe）被认为是最具肝毒性的之一[3,4]。Spe存在于Senecio属的多种植物中，尤其在某些草药中含量丰富，例如Gynura segetum[5]。例如，Gynura japonica中的Spe浓度约为234.3 μg/kg，对人类健康构成风险[6]。先前的研究表明，Spe可诱导小鼠肝细胞中的线粒体损伤，包括线粒体去极化、线粒体膜电位（MMP）下降和细胞色素c（Cyt c）释放[7]。然而，其潜在机制仍不明确。揭示Spe诱导的线粒体功能障碍的分子基础是识别PA中毒亚细胞毒理学特异性的关键步骤。
目前，多个组织已采取措施限制PA的暴露及相关健康风险[8]。然而，大多数PA的基准剂量（BMD）等起点数据缺失，阻碍了其风险评估，因为需要体内毒性数据来推导这些数据[9]。考虑到经济和伦理限制，使用动物进行所有相关PA的毒理学研究存在局限性。为解决这一问题，采用基于生理学的药代动力学（PBPK）建模辅助的反向剂量学方法将体外浓度-反应曲线转换为体内剂量-反应曲线，已成为主要的评估策略[10]。多项研究表明，这种方法可以准确预测体内毒性[11,12]。迄今为止，尚未开发出用于预测Spe体内毒性的PBPK模型。此外，也缺乏Spe的体内毒理学数据。因此，迫切需要开发Spe的PBPK模型并进行毒理学研究以验证模型的预测准确性。
在这里，我们旨在研究Spe引起的线粒体功能障碍的分子机制，并探讨这些数据是否可用于预测体内肝脏毒性。为此，我们进行了代谢和转录组分析，以揭示Spe诱导的线粒体损伤的分子特征。进一步通过小鼠实验研究了Spe引起的线粒体功能障碍相关的肝脏损伤。更重要的是，我们建立了Spe诱导肝毒性的PBPK模型，并将体外线粒体反应曲线得出的预测起点（PoDs）与小鼠实验得出的PoDs进行了比较以进行验证。
实验部分
小鼠原代肝细胞的分离
原代肝细胞是从5至6周大的雄性C57BL/6J小鼠中新鲜分离得到的，购自北京Speifu生物技术有限公司，具体方法如前所述[14]，并在补充信息中提供了部分修改内容。该动物实验获得了北京朗科生物技术有限公司动物福利委员会（IACUC-20230618-01）的批准。
细胞活力测定
原代肝细胞以约2.0 × 104个细胞/孔的密度接种在96孔板中
Spe诱导小鼠原代肝细胞中的线粒体损伤
用Spe处理小鼠原代肝细胞时，我们观察到细胞活力随浓度增加而下降，EC50值为35 μM（图1A）。在17.5 μM（相当于肝毒性的1/2EC50）及更高浓度下，Spe显著增加了ROS的产生并降低了MMP（图1B和C）。虽然细胞内Ca2+水平保持不变，但从1/4 EC50开始，线粒体Ca2+呈剂量依赖性升高（图1D和图S2）。透射电子显微镜（TEM）分析显示...
讨论
尽管PA引起的肝细胞细胞毒性和基因毒性已有充分记录，但它们对线粒体功能及相关分子特征的影响尚不明确。本研究显示，高肝毒性的Spe可诱导氧化应激相关的线粒体损伤。我们进一步揭示了线粒体能量代谢、抗氧化防御和凋亡的分子变化。更重要的是，我们开发了一个PBPK模型来预测Spe的肝脏毒性，并证明了...
CRediT作者贡献声明
陆宇顺：撰写初稿、可视化处理、验证、软件使用、实验设计、数据分析、数据整理。马江：验证、软件使用、方法学设计、数据分析、数据整理。耿远：实验设计、数据分析、数据整理。张冰雁：数据分析、数据整理。丁峥：数据分析、数据整理。史晓莉：数据分析、数据整理。徐艳阳：数据分析、数据整理。邱静：数据分析、数据整理。钱永忠：数据分析
声明
动物实验和小鼠原代肝细胞的分离均获得了伦理批准（IACUC-20230618-01），并完全符合中国国家法规。本手稿不包含临床研究或患者数据。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：
陈璐报告称，设备、药物或试剂由国家自然科学基金提供。陈璐拥有专利#ZL 2024 1 1497995.7。作者声明没有其他可能被视为利益冲突的关系或活动。如果有其他作者，他们也声明没有此类情况
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32202184）、中国农业科学院的国家基础研究基金（编号：1610072025002）、农产品质量安全国家重点实验室（编号：SKLOSAP-KF202620）、中国农业大学2115人才发展计划、国家自然科学基金（编号：82304859）以及广东省基础与应用基础研究基金（编号：2022A1515110678）的支持。
我们希望...
