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纳米载体尺寸调控免疫细胞间动态传递机制研究。通过构建不同尺寸的聚合物纳米胶囊（PNCs）并研究其T细胞与巨噬细胞间的接触再分配，发现纳米颗粒曲率影响膜接触面积及界面粘附平衡，小颗粒（<300nm）因高曲率更易稳定附着，大颗粒（>300nm）因接触面积不足导致转移效率降低。建立双参数定量模型解析纳米载体脱离与捕获的竞争机制，揭示尺寸窗口（200-400nm）实现最优转移效率。该成果将经典胶体界面理论应用于生物医学工程领域，为设计可控纳米药物递送系统提供理论依据。
玛丽娜·诺沃谢洛娃|德米特里·戈林|阿纳托利·阿巴雷莫夫
光子科学与工程中心，斯科尔科沃科学技术研究院，莫斯科121205，俄罗斯
摘要
越来越多地研究使用免疫细胞作为非吞噬性载体平台来传递表面结合的纳米材料，用于细胞介导的递送和生物混合系统。然而，表面相关纳米载物的胶体性质如何控制其在动态细胞-细胞相互作用过程中的重新分布仍 largely 未知。在这里，我们报告聚合物纳米胶囊（PNCs）的大小对其从作为载体细胞的 T 细胞到巨噬细胞（MΦ 细胞）的接触介导的重新分布具有关键性影响。通过逐层方法制备了具有确定直径的单分散聚合物纳米胶囊，并将其与 T 细胞表面结合。荧光显微镜和流式细胞术显示，纳米胶囊的重新分布与血清蛋白无关，但强烈依赖于直接的细胞-细胞接触和巨噬细胞的激活状态。较小的 PNCs 可稳定地保留在 T 细胞上，而较大的 PNCs 则更容易脱落，但被 MΦ 细胞捕获的效率较低。我们引入了一个定量模型，以分离纳米胶囊从供体细胞表面的脱落和在细胞-细胞接触期间的捕获效率，确定了两种不同的细胞间交换机制以及最大重新分布效率的大小范围。这些发现将细胞间纳米载物的交换视为一种由动态细胞膜上的曲率依赖的膜接触面积和界面粘附平衡所控制的胶体-生物界面现象。这项工作展示了如何将经典的胶体和界面概念应用于基于表面的细胞介导系统，并为接触依赖的纳米载物传递提供了物理化学设计原则。
引言
免疫细胞之间的相互作用是许多关键免疫监视、激活和解决过程的基础。[1]、[2]、[3] 在这些过程中，近年来特别关注了分子和颗粒信号的接触依赖性交换，尤其是在抗原呈递[4]、吞噬作用[5]以及工程纳米载物的递送[6]的背景下。从胶体和界面科学的角度来看，这种免疫细胞接触代表了高度动态的生物界面，在这些界面中，合成胶体物体经历了竞争性的粘附力、扩散力和接触介导的力。T 细胞和 MΦ 细胞分别是适应性和先天免疫中的两个核心参与者[7]，它们经常在淋巴组织和炎症环境中共定位，它们的物理和功能相互作用有助于塑造下游的免疫反应[8]、[9]。然而，这些免疫细胞类型之间物质转移的机制细节和功能后果仍然知之甚少[10]。
表面功能化的淋巴细胞最近被证明是用于靶向药物输送的有前景的载体，具有免疫优先的迁移能力、归巢能力和延长的循环时间[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。许多研究表明，纳米颗粒或聚合物载体可以通过静电、疏水或受体介导的相互作用与淋巴细胞结合，形成保持细胞活力和迁移功能的细胞-颗粒混合物[13]、[15]、[16]、[17]。然而，这些结构在动态多细胞环境中的稳定性仍然是一个未解决的问题，特别是在存在能够识别和内化外源物质的吞噬细胞的情况下[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。
从工程学的角度来看，淋巴细胞越来越多地被探索作为表面相关纳米载物的载体细胞[11]。与专业的吞噬细胞不同，T 细胞缺乏有效的内吞和吞噬机制，因此无法内化或降解纳米级物体[24]、[25]。因此，纳米颗粒和纳米胶囊可以稳定地与 T 细胞的外部表面结合，从而实现其运输而不会被细胞内隔离[26]、[27]。重要的是，由 T 细胞携带的表面相关货物在细胞-细胞相互作用时可以直接传递给目标细胞。这使基于淋巴细胞的载体系统与基于巨噬细胞的递送方法区分开来，在后者中，纳米载物的内化可能会限制直接传递并降低对货物转移的空间控制[6]、[28]、[29]。然而，在这种基于表面的载体系统中，一个关键且尚未充分探索的挑战是在动态多细胞条件下纳米货物保留的稳定性[30]、[31]。目前尚不清楚表面相关的纳米胶囊是否能在长时间的循环和重复的细胞-细胞接触中在淋巴细胞膜上牢固地保留，或者它们是否容易脱落并被周围细胞捕获。解决这个问题对于合理设计表面功能化的载体细胞至关重要，也是本研究的动机。
在基于表面的载体系统中，巨噬细胞代表了一种特别严格的受体细胞类型。作为专业的吞噬细胞，它们不断扫描其微环境中的外来颗粒、凋亡细胞和病原体[32]、[33]、[34]。除了经典的吞噬作用之外[35]、[36]，巨噬细胞还能够通过接触介导的过程从邻近细胞中提取膜片段或表面相关成分[37]、[38]。这些特性使巨噬细胞成为评估非吞噬细胞携带的表面相关纳米货物稳定性的相关最坏情况模型。特别是，与巨噬细胞的直接接触可能会促进表面结合的纳米载物的脱落和捕获，这就提出了一个问题：这样的货物是否可以在载体细胞膜上保留，或者在细胞-细胞相互作用时优先传递，尤其是在机械动态条件下[39]、[40]。
为了应对这一挑战，我们研究了非吞噬性淋巴细胞携带的表面相关聚合物纳米胶囊（PNCs）与其他细胞接触时的命运。使用 T 细胞作为代表性的载体细胞类型，巨噬细胞作为严格的吞噬受体模型，我们关注了控制纳米胶囊保留与接触介导捕获的生物界面驱动机制。我们的方法不是模拟特定的免疫生态位，而是解决了细胞间纳米货物重新分配的一般物理化学规则。通过系统地改变胶囊大小（150纳米、300纳米、500纳米）这一关键胶体参数，我们证明了接触介导的传递受纳米尺度界面相互作用的控制。这一现象通过荧光显微镜进行了可视化，并使用多参数流式细胞术进行了量化，从而能够解析细胞-细胞生物界面上的混合群体和传递事件。
材料
二水合氯化钙（CaCl?·2H?O）、牛血清白蛋白（BSA）、单宁酸（TA）、碳酸氢钠（NaHCO?）、聚-L-精氨酸盐酸盐（PARG，分子量 > 70,000）、硫酸葡聚糖钠盐（DEX，分子量 ≈ 100,000）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、硫氰酸铵（NH?SCN）、盐酸（HCl）、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na?）、氯化钠（NaCl）和 PrestoBlue 细胞活力试剂均从 Sigma–Aldrich（美国）购买，并按原样使用。
细胞间转移实验（T 细胞-巨噬细胞共培养）
然后用 PNC 标记的 Jurkat T 细胞与 RAW264.7 MΦ 细胞以大约 1:1 的比例混合。在 37°C 下温和搅拌共培养 2 小时，以促进细胞-细胞接触并保持细胞活力。共培养后，收集细胞，用 PBS 清洗以去除非相关物质，并通过流式细胞术和荧光显微镜进行分析。选择 1:1 的比例作为高接触共培养模型，以确保足够的接触。
MΦ 细胞极化
RAW 264.7 小鼠 MΦ 细胞被用作模型巨噬细胞系。对于极化实验，细胞在含有 10% FBS 的完全 DMEM 中培养过夜。为了诱导 M2 极化的 MΦ 细胞，RAW 264.7 细胞在含有 20 ng/mL IL-4 的完全培养基中培养 24 小时。为了诱导 M1 极化的 MΦ 细胞，细胞用 10 ng/mL 脂多糖（LPS）和 100 IU/mL 干扰素-γ（IFN-γ；PeproTech）处理 24 小时。未刺激的 MΦ 细胞则保持原状培养。
流式细胞术
Jurkat T 细胞预先用 Calcein AM 标记以识别存活细胞，而 RAW264.7 MΦ 细胞用 Hoechst 33342 染色以区分吞噬细胞群体。在 Jurkat 细胞表面用 Cy5 标记的 PNCs 功能化后，T 细胞和 MΦ 细胞在 37°C 下温和搅拌共培养 2 小时，以允许细胞间相互作用和潜在的胶囊传递。流式细胞术分析使用 CytoFLEX 流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）进行。PNCs 的合成
为了获得具有确定直径的单分散 PNCs，采用了一种逐步模板化方法，使用碳酸钙（CaCO?）微粒作为核心（图 1a）。使用了两种合成策略来制备不同大小的 CaCO? 颗粒：500纳米的颗粒是通过在甘油存在下混合 Na?CO? 和 CaCl? 获得的，这减缓了晶体生长并促进了球形形态的形成。相比之下，较小的 300纳米颗粒是通过在 85% 乙醇中反应 NaHCO? 和 CaCl? 合成的。
从 T 细胞到 MΦ 细胞的 PNCs 细胞间转移
在这个实验中，使用免疫细胞的共培养模型来评估 PNCs 在 T 细胞和 MΦ 细胞之间的转移。首先用三种不同直径的 Cy5 标记的 PNCs（150纳米、300纳米和 500纳米）功能化 T 细胞，然后在 37°C 下温和旋转搅拌共培养 2 小时。选择 2 小时的培养时间是因为它反映了血液或组织环境中细胞-细胞相互作用的典型持续时间。
结论
在这项工作中，我们分析了表面相关聚合物纳米胶囊的胶体性质如何影响它们在免疫细胞-细胞相互作用过程中的重新分布。通过系统地改变胶囊大小和巨噬细胞的激活状态，我们证明了细胞间纳米货物的重新分布是由动态免疫细胞生物界面上的接触介导过程控制的，而不是由血清介导或纯粹的物理化学效应控制的。我们的结果揭示了胶囊大小通过
资助
这项工作得到了国家“超级博士后”激励计划的资助。A.A. 是杰出青年学者科学基金的获得者。
数据可用性声明
所有数据、相关方法和材料来源都在正文中提供。
CRediT 作者贡献声明
玛丽娜·诺沃谢洛娃：撰写——原始草稿、方法论、研究、数据管理、概念化。德米特里·戈林：撰写——原始草稿、监督、资源管理、项目管理。阿纳托利·阿巴雷莫夫：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、监督、资源管理、项目管理、方法论、研究、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
