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硒纳米颗粒稳定性与抗肿瘤机制研究。通过响应面法优化COS-SA修饰制备均匀稳定的硒纳米颗粒，抑制HepG2细胞增殖并诱导铁死亡。
Jingru Li|Ziyan Guo|Xinghan Zhao|Chengyang Lei|Xingchen Zhai|Difeng Ren|A.M. Abd El-Aty
北京林业大学生物科学与技术学院，森林食品加工与安全重点实验室，中国北京100083
摘要
增强氧化还原失衡已成为有效的癌症治疗策略。硒纳米颗粒（SeNPs）在这方面具有潜力，但其稳定性有限。在这项研究中，我们制备了新型壳寡糖-海藻酸钠（COS-SA）修饰的SeNPs（COS-SA-SeNPs），并通过响应面方法优化了合成过程以控制粒径。研究了其形成、形态、理化特性和稳定性机制。结果表明，COS-SA-SeNPs呈橙红色，含有零价硒，为均匀的球形纳米颗粒，平均直径为158纳米。由于COS-SA与SeNPs之间的分子间作用力，COS-SA-SeNPs的加热和储存稳定性更好。此外，这些稳定的纳米颗粒在HepG2细胞中表现出强烈的抗增殖活性。观察到了活性氧（ROS）过量产生、铁含量增加、抗氧化酶活性下降以及铁死亡相关基因（如Nrf2/HO-1、SLC7A11和GPX4）下调，表明细胞氧化还原稳态被破坏，铁死亡发生。COS-SA-SeNPs通过破坏氧化还原稳态并同时削弱细胞抗氧化防御机制来发挥抗肿瘤作用。这项研究不仅为营养硒补充提供了另一种选择，还为通过增强氧化还原失衡介导的铁死亡癌症治疗提供了新的视角。
引言
铁死亡是一种依赖铁的细胞死亡形式，由脂质过氧化驱动，是一种有前景的抗肿瘤策略。然而，目前的铁死亡诱导剂依赖于化学合成化合物，这些化合物涉及复杂的过程，需要有机试剂，并具有副作用。例如，FDA批准的药物索拉非尼通过抑制谷胱甘肽合成来诱导铁死亡，但可能导致严重的心血管并发症[1]。因此，开发更安全、更有效的铁死亡诱导剂仍然是一个关键挑战。
癌细胞中活性氧（ROS）水平的升高使其对进一步增加ROS水平的物质敏感[2]。然而，肿瘤通过增强抗氧化系统（包括硫氧还蛋白和谷胱甘肽途径）来对抗氧化应激[4]。值得注意的是，关键成分如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是硒蛋白，为基于硒的治疗策略提供了分子基础。
与传统硒形式相比，纳米硒（SeNP）具有更高的生物利用度和更低的毒性[5]。它们可以被肿瘤细胞内化，通过产生ROS和破坏氧化还原平衡来诱导细胞死亡[6]、[7]。然而，它们的应用受到固有不稳定性和聚集性的限制[8]。多糖由于其分支结构和羟基，是生产单分散和生物活性SeNPs的有效稳定剂[9]、[10]。例如，来自Dendrobium officinale和Tribonema的多糖分别被用于增强免疫功能和抗氧化活性[11]、[12]，而地衣素包覆的SeNPs已被证明能对抗ROS[13]。尽管取得了这些进展，但仍迫切需要多糖稳定的SeNPs，尤其是在抗肿瘤治疗方面。
海洋多糖如海藻酸钠（SA）是一种GRAS认证的生物相容性凝胶剂[14]，但存在热敏感性和耐水性差的问题。壳寡糖（COS）是一种带正电荷的壳聚糖衍生物，具有抗菌和抗氧化活性，可以解决这些问题。研究将COS和SA结合使用，制备出网络密度和功能更强的材料[15]、[16]。然而，它们对硒纳米颗粒（SeNPs）的联合效应尚未探索。我们之前的工作表明，COS通过ROS途径诱导肿瘤细胞凋亡[17]。SeNPs同样会破坏氧化还原平衡[7]、[13]，但面临不稳定性和细胞摄取不良的问题。我们假设用COS和SA修饰SeNPs可以提高其稳定性，并协同增强氧化还原失衡以诱导肿瘤细胞死亡。虽然已经研究了多糖修饰的SeNPs[18]、[19]，但很少有系统能够同时增加ROS水平并抑制抗氧化防御，同时作为强效的铁死亡诱导剂。硒缺乏普遍存在[20]，而膳食补充与降低癌症风险相关[21]、[22]。因此，开发既满足营养需求又具有治疗潜力的新型生物相容性硒来源是必要的。
在这项研究中，使用壳寡糖-海藻酸钠复合物（COS-SA）作为稳定剂，合成了新型硒纳米颗粒（COS-SA-SeNPs）。通过单因素实验和响应面方法优化了合成过程，以获得最小的粒径。这些纳米颗粒在各种条件下表现出良好的稳定性，其结构分析阐明了COS-SA与SeNPs之间的相互作用。抗肿瘤评估显示，COS-SA-SeNPs通过充当抗氧化剂清除剂和ROS诱导剂来抑制HepG2细胞增殖。进一步分析表明，它们抑制了关键的铁死亡相关抗氧化基因。这项工作提供了COS-SA-SeNPs作为潜在基于硒的抗肿瘤剂的初步体外评估，这些纳米颗粒通过同时诱导氧化应激和抑制抗氧化防御来发挥作用，为未来的体内研究和铁死亡介导的癌细胞死亡提供了基础。
材料
壳聚糖寡糖（COS）是通过酸水解来自浙江丰润生物科技有限公司（中国台州）的中分子量壳聚糖制备的，平均摩尔质量为1000 g/mol。COS的分子量通过还原糖与铁氰化物离子的反应确定[23]。脱乙酰化程度为95.3±1.3%，通过碱性滴定测量[17]。COS的聚合度通过离子色谱法结合其他方法确定为2–6
COS-SA-SeNP制备的优化
COS-SA-SeNPs是通过使用COS-SA作为修饰剂，用Vc还原Na?SeO?合成的。最佳COS:SA质量比为1:10，获得了最小的粒径（图1A）。8 mmol/L的Na?SeO?浓度也导致了最小的粒径（图1B）。尽管2:1的Vc:Na?SeO?比例是化学计量的，但选择了稍微过量的比例（4:1）以确保完全还原，同时避免Vc引起的颗粒聚集[27]（图1C）。基于单因素实验，进行了三因素实验
结论
在这项研究中，我们通过优化壳寡糖（COS）、海藻酸钠（SA）和SeNPs的制备过程，成功开发出了物理和化学上稳定的COS-SA-SeNPs。这些纳米复合材料在各种恶劣条件（如储存、温度、pH值和离子强度）下表现出优异的稳定性，这归因于COS-SA与SeNPs之间的分子间作用力。值得注意的是，COS-SA-SeNPs在ROS环境中的可变氧化还原电位
CRediT作者贡献声明
Jingru Li：撰写 – 原始草稿，可视化，验证，正式分析。Ziyan Guo：方法学，研究，数据管理，概念化。Xinghan Zhao：可视化，软件，正式分析。A. M. Abd El-Aty：撰写 – 审稿与编辑，正式分析。Difeng Ren：监督，资源提供。Chengyang Lei：可视化，软件。Xingchen Zhai：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源提供，项目管理，资金获取。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32201052）、战略科学家科技创新项目（编号：KG20241031）以及北京林业大学的“5?5工程研究与创新团队项目”（编号：BLRC2023B08）的支持。
