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本研究利用全基因组关联分析（GWAS），揭示了安纳托利亚雪熊蜂（Bombus niveatus）白色与黄色拟态色斑差异的遗传基础，将关键变异锁定在发育同源盒基因BarH上游顺式调控区一个称为“snowy”的位点。该位点在白色型中发生了一个特有的409 bp串联重复，可能通过增加转录因子结合位点数量来调控色素沉积。研究还通过对一个罕见的、体色双侧镶嵌的雌雄嵌合体进行遗传学分析，进一步支持了该位点对颜色的控制以及两种色型属于同种的观点。这些发现增进了我们对昆虫拟态表型趋同进化遗传机制的理解。
引言
熊蜂（Bombus spp.）不仅是全球重要的传粉昆虫，其体毛毛色模式也展现出惊人的多样性，这很大程度上是由穆氏拟态（Müllerian mimicry）所驱动。在这种拟态中，共同分布的有毒物种会趋同于相似的警戒色以威慑捕食者。在安纳托利亚地区，一个独特的白色拟态复合体尤为突出，约有15个物种通过将祖先的黄色体毛转变为白色，独立地趋同于一种白色斑纹模式。这为研究颜色转换和拟态趋同的遗传基础提供了绝佳的系统。
本研究聚焦于安纳托利亚中部一种白-黄二态性的物种——雪熊蜂（Bombus niveatus）。历史上，白色型（B. niveatus niveatus）和黄色型（B. niveatus vorticosus）曾被视作两个不同物种，但后续的化学、形态学和遗传证据支持它们为同一种内的颜色二态型。这两种色型很可能是在拟态选择压力下，为趋同于该地区的白色区域颜色模式而演化形成的。
安纳托利亚的拟态
分布图显示，白色型熊蜂的分布核心在安纳托利亚东部地区，而黄色型在该区域外更为常见。将白色拟态物种及其姊妹类群映射到系统发育树上，可以看到白色型在安纳托利亚地区是高度趋同的，它们散布在多个不同的谱系中，并且频繁地从祖先的黄色型演化而来，导致了约15个物种出现种内黄-白多态性。
群体结构、GWAS与连锁分析
为了解析雪熊蜂白-黄颜色转换的遗传基础，研究人员对来自安纳托利亚中部过渡带5个采集点的18只白色型和18只黄色型雄性个体进行了全基因组测序。主成分分析（PCA）显示，除了部分地点特异的分离外，两种色型在基因组水平上是混合的，不支持它们存在群体或物种水平的区分，这为它们是同一种提供了证据。
针对颜色的全基因组关联分析（GWAS）发现了一个单一且显著的关联峰。该峰位于同源盒基因BarH上游约7.5 kb处的顺式调控区域，包含5个与表型完全固定的单核苷酸多态性（SNP）。通过人工检查整合基因组视图（IGV），研究人员进一步发现，除了这些SNP，黄色型个体在该区域的测序读数覆盖度存在下降，暗示可能存在大片段的缺失或变异。深入分析揭示，在白色型（B. n. niveatus）的参考基因组中，该区域存在一个409 bp的串联重复，而黄色型（B. n. vorticosus）则缺乏这个重复。研究人员将这个包含SNP变异和串联重复的区域命名为“snowy”位点，以反映其对雪熊蜂白色表型的控制。
连锁不平衡（LD）分析显示，在包含该关联峰的~14.84 Mbp的contig上，除了一个跨越该峰区域的~1.6 kb大LD块（r2> 0.75）外，连锁程度非常低。只有BarH的顺式调控区落在这个连锁块内。此外，在距离snowy位点8.2 kb的一个BarH外显子中，也发现了一组与之高度连锁（r2> 0.70）的SNP，暗示该顺式调控域与蛋白质编码序列之间存在某种程度的连锁。专门针对颜色关联位点周围15kb区域进行的PCA，成功地将样本按颜色完全分开。
跨物种序列验证
通过PCR和Sanger测序对snowy区域进行验证，结果确认了生信分析发现：所有白色型个体都含有一个黄色型个体所缺乏的409 bp重复序列。在白色型中，5个固定的SNP差异位于其中一个重复拷贝（“祖先区域”），而另一个独有的重复拷贝（“重复区域”）则有9个碱基不同于祖先序列。
有趣的是，一个黄色型个体（VOR1_8）虽然也只有一个拷贝，但其序列更类似于白色型的“重复区域”，而非典型的黄色型“祖先区域”序列。这使得真正固定于表型的SNP减少为3个，外加这个缺失/重复变异。对雪熊蜂最近的黄色姊妹种B. sulfureus的测序显示，它同样缺少这个“重复”区域。单倍型网络分析提示，白色型可能通过合并两个不同的黄色型单倍型（例如，在减数分裂过程中因序列比对错误产生串联重复）而演化形成。
为了评估snowy位点的变异是否在安纳托利亚地区其他具有白-黄变异的共拟态近缘物种中共享，研究人员对7个黄色型和8个白色型物种的同一顺式调控区进行了测序。结果显示，在雪熊蜂中观察到的串联重复在其他任何物种（无论颜色）中均未检测到。其他白-黄物种对之间也没有共享明确的变异模式。这表明，导致该地区拟态表型平行演变的因果突变在其他谱系中是不同的，揭示了趋同的遗传机制驱动了这些拟态模式。
颜色位点的等位基因显隐性
对少数可用的工蜂样本进行PCR和测序分析表明，黄色工蜂在该位点为纯合缺失型（a/a，无重复），而白色工蜂均为杂合子（A/a，有重复）。这些数据表明，白色的重复等位基因（A）对黄色的缺失等位基因（a）为显性。
转录因子结合位点变异
通过对白色型单倍型、典型黄色型单倍型和特殊黄色型（VOR1_8）单倍型进行转录因子结合位点（TFBS）预测分析发现，白色单倍型（包含重复区域及其相邻的祖先区域）拥有更多的转录因子结合位点（296个），而黄色单倍型（无重复）则较少（分别为167和157个）。白色型特有的重复区域本身就贡献了139个TFBS，并且保留了与黄色单倍型相同的70个基序家族。
虽然只有三个JASPAR基序为白色单倍型独有，但它们并非由固定的SNP引入。在白色型中，由于重复区域增加了这些TF的结合位点拷贝数，因此其TFBS总数仍多于黄色型。对基序丰度的检查显示，与黄色型相比，白色单倍型中一组发育/同源域因子的结合位点显著增加，包括Ladybird early（lbe）、Distal-less（Dll）、Antennapedia（Antp）等。这些变化可能通过改变结合位点数量和阈值响应来调节基因的表达输出。
雌雄嵌合体（Gynandromorph）的分析
一般双侧镶嵌性
研究描述并分析了一个罕见的雪熊蜂雌雄嵌合体。该标本表现出明显的、但不完全的双侧分裂：从背部视角看，身体右半部分更多显示雌性典型形态和白色体毛，而左半部分则更多显示雄性典型形态和黄色体毛。然而，多个解剖区域（如小盾片、第一腹节T1）显示出中间或斑块状的镶嵌模式。
头、眼和触角形态
头部特征呈现清晰的双侧分裂。雪熊蜂雄性复眼大于雌性。在该嵌合体中，左侧（雄性）复眼的大小和形状与典型雄性相符，而右侧复眼较小，其大小和形状介于典型雄性和雌性之间。触角分节进一步证实了双侧分裂：左侧（黄色侧）触角鞭节较长，符合雄性特征；右侧（白色侧）触角鞭节较短，符合雌性特征。
遗传学基础
表型上，具有雌性特征的体部区域往往呈白色，而具有雄性特征的区域呈黄色。由于膜翅目昆虫中雌性为二倍体（2n），雄性为单倍体（n），最简单的解释是：在部分细胞中发生了染色体组的体细胞丢失，产生了带有缺失等位基因（黄色）的单倍体（雄性）细胞，以及在颜色位点为杂合的二倍体（雌性）细胞。
对来自右触角（RA）、左触角（LA）、左侧黄色侧板（YP1）和右侧白色侧板（WP1）四个组织的基因组分型支持了这一推测。基于全基因组杂合度水平，右触角主要为二倍体细胞（雌性），左触角为单倍体细胞（雄性）。在snowy位点，雌性侧触角为杂合子（A/a，白色型），而雄性侧触角为黄色等位基因的单倍体（a）。雄性腿和雌性腿的PCR数据也符合预期。
然而，一个意外的发现是，右侧白色侧板（WP1）在基因组水平被推断为单倍体，并且只含有白色等位基因（A）。这表明部分白色组织是单倍体雄性。而左侧黄色侧板（YP1）的基因组样本出乎意料地为二倍体且为杂合子，这与白色等位基因为显性的推断不符。对该区域更黄部分的第二次采样显示，其主要是黄色型的单倍体，但测序也检测到部分白色型等位基因。因此，YP1区域很可能是一个包含两种等位基因细胞的嵌合体。
单倍体与二倍体细胞谱系比较
通过比较二倍体组织与两个单倍体组织之间的变异位点，发现大多数在二倍体中杂合的位点在两个单倍体中是不同的，表明这两个单倍体很可能来源于该二倍体细胞的两套染色体。然而，仍有一部分在两个单倍体间存在差异的位点在二倍体中是纯合的，且这些独特的单倍体等位基因在染色体上分布均匀。进一步分析表明，被标注为“二倍体”的右触角（RA）组织可能并非纯粹的二倍体，其中可能混有带有WP1“白色”单倍型的单倍体雄性细胞，这可能导致生物信息学分析出现偏差。这并不意外，因为形态学数据（如右触角柄节长度、右复眼大小）已提示头部可能是细胞的嵌合体。
讨论
BarH的顺式调控与颜色变异
snowy位点的定位暗示，对BarH基因的顺式调控改变很可能是影响这些熊蜂着色体毛发育的最可能候选机制。BarH作为一个选择者同源盒基因，在果蝇中已知功能与本研究中的发现高度相关：1）它影响胸部的空间模式，与这些熊蜂体节上的颜色模式相关；2）它与依赖achaete–scute的感器发育相互作用，调控表皮突起（在熊蜂中即体毛）的模式；3）它与蝶啶（pterin）色素有关，在蝴蝶中，BarH1的一个增强子被证实驱动了白-黄蝶啶变异。熊蜂的黄-白体毛着色很可能也是由蝶啶色素的变化所驱动。因此，BarH可能通过控制前体区域蝶啶色素的沉积来发挥作用。
这一发现符合熊蜂拟态遗传学的一个更广泛模式，即主要的发育同源盒基因往往是颜色模式的关键驱动者。例如，北美拟态复合体中红-黑颜色的变异与后腹部Hox基因Abd-B的调控区变化有关。本研究表明另一个同源盒基因位点（BarH）参与了颜色形成，进一步凸显了发育基因如何被招募来驱动外部成虫模式的重大局部变化。
BarH颜色位点的演化与潜在功能
雪熊蜂的案例表明，拟态产生的相似表型源于独立的遗传突变。跨共拟态谱系的比较测序显示，串联重复是雪熊蜂独有的。在三个固定SNP中，大多数在共拟态种中是可变的，并未形成一个跨物种的白色单倍型诊断标记。这些模式表明，重复和涉及的SNP大多是雪熊蜂特有的，其他未识别的变异（可能在该基因或其他位点）解释了共拟态熊蜂中的平行变化。
我们的计算机调控分析指出，snowy位点转录因子结合的改变可能促成黄-白颜色转换。白色型特有的重复大幅增加了现有TFBS的数量，显著提高了多个发育转录因子的局部结合潜力，从而可能通过改变结合位点数量和阈值响应来调节调控输出。相比之下，检测到的固定SNP仅轻微改变了预测的结合构型。我们的数据表明，结合位点数量的差异在驱动表型方面更为重要。
小规模的拷贝数变化可以通过改变结合位点密度或增强子强度来驱动表达的巨变。此外，调控序列的重复拷贝可能通过获得新的调控功能而发挥新功能。我们的数据支持该位点遵循经典的孟德尔遗传模式，黄色个体为非重复等位基因的纯合子，白色个体为重复等位基因的纯合或杂合子，这与白色插入等位基因为显性一致。一种机制性解释是，即使只有一个重复等位基因，也可能通过扩增转录因子结合位点，将调控活性提升到产生特定表型所需的阈值之上。
黄-白雌雄嵌合体的遗传学
被解剖的双侧雌雄嵌合体提供了一个在个体内测试颜色等位基因如何转化为表型的机会，同时也揭示了该嵌合体产生的机制。对采样组织的分子和基因组数据分析与体细胞嵌合现象一致。PCR和测序检测显示，重复基因型与组织颜色相对应。综合来看，该标本可能包含三种体细胞谱系：二倍体（2n）雌性细胞、与黄色体毛相关的单倍体（n）雄性细胞（黄色等位基因），以及与白色体毛相关的第二类单倍体（n）雄性细胞（白色等位基因）。
该嵌合体最好被描述为部分双侧镶嵌型。其形成机制最有可能的解释是：正常的受精（产生二倍体合子）发生后，二倍体染色体组在早期细胞分裂中分裂成两套单倍体组/细胞，从而产生两种单倍体细胞谱系， alongside 一些残留的二倍体细胞。
使用颜色界定物种的问题
历史上，B. niveatus和B. vorticosus仅依据颜色被定义，直到最近才被归为同种。我们的基因组数据显示两种色型属于混合群体，而雌雄嵌合体则进一步支持了它们是同一物种，因为两种色型出现在同一个体中。穆氏拟态将颜色变异与物种边界解耦，因为区域选择有利于种内多态性和跨物种趋同，这干扰了物种诊断。本案例再次说明，颜色（常被用作熊蜂分类的关键鉴别特征）作为唯一的物种界定标准是不可靠的。雪熊蜂中的白-黄多态性由单个基因座以简单的孟德尔方式控制，因此很容易获得或丢失。这种简单的颜色遗传模式在其他熊蜂系统中也有发现。
结论
通过结合关联作图、比较测序和利用雌雄嵌合体验证，我们揭示了雪熊蜂白色拟态型是一个衍生状态，很可能是由BarH基因中一个谱系特异的顺式调控重复所产生。这些发现将受益于后续的功能实验验证，例如通过转录组学检测这是否导致BarH的差异表达，或通过基因编辑（如移除重复区域）进行验证。同时，色素生化分析应确认白色型是代表了蝶啶（或其他）色素途径的主动抑制，还是色素沉积的结构性失败。要确定BarH反映的是一个被反复利用的最佳遗传靶点，还是一个谱系特异的机遇，需要在该拟态复合体的共拟态物种中进行比较功能学研究。
较大的结构变异，如BarH的顺式调控重复，使用标准短读长测序方法难以检测。在本案例中，该重复仅因连锁SNP的固定差异而被发现。当使用短读长测序进行GWAS时，应考虑评估读数覆盖度下降或其他拷贝数变异特征的方法，以捕捉完整的因果变异频谱。
最后，安纳托利亚拟态复合体是一个杰出的比较系统，值得进一步研究。该地理区域展现了向白色带表型的重复趋同，包括跨谱系丰富的种内多态性，适合于评估该拟态系统中趋同进化的遗传基础和演化规律。通过结合比较遗传学、调控预测以及未来的表达和功能实验，该系统可以阐明颜色进化的近期机制，以及支配这种拟态的更广泛的演化规律。
