《Current Opinion in Biomedical Engineering》：Targeting and Editing DNA Methylation and Hydroxymethylation for Gene Therapy
编辑推荐：
这篇综述系统梳理了DNA甲基化（DNAme）与羟甲基化（5hmC）作为基因治疗靶点的最新进展。文章详细介绍了基于CRISPR等平台的表观基因组编辑策略（如CRISPRoff/on、EvoETR），阐述了如何通过靶向重编程DNAme来治疗癌症、代谢病、衰老、感染性疾病及遗传印记异常等多种疾病，并讨论了其临床转化面临的挑战。
引言：表观遗传调控与疾病
DNA甲基化（DNAme）与羟甲基化是调控基因表达的核心表观遗传标记。5-甲基胞嘧啶（5mC）通常与基因沉默相关，尤其当其出现在基因启动子或增强子区域时。相反，5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）常被视为DNA主动去甲基化途径的中间产物，也与基因激活相关联。DNA甲基转移酶（DNMTs，如DNMT3A/3B与辅助因子DNMT3L）负责建立de novo甲基化，而DNMT1负责在DNA复制中维持该模式。TET酶（TET1/2/3）则催化5mC转化为5hmC，启动去甲基化过程 。这些标记的失调与癌症、肥胖、感染性疾病、衰老及干细胞重编程等多种病理生理过程密切相关，使其成为极具潜力的治疗靶点。
表观基因组编辑策略与平台
与传统的基因敲除或RNA干扰相比，表观基因组编辑能够在不断裂DNA双链的前提下，可逆且持久地改变基因表达，安全性更高。其核心技术是将一个DNA结合结构域（如锌指蛋白ZF、TALE或催化失活的dCas9）与一个或多个表观遗传效应结构域（如DNMT或TET的催化域）融合，从而实现对特定基因组位点甲基化状态的精确操控。
目前已有多种先进的编辑平台被开发出来，旨在优化编辑效率、持久性和递送可行性：
- •
CRISPRoff/on系统：CRISPRoff将dCas9与DNMT3A催化域、辅助因子DNMT3L及KRAB结构域融合，能在靶位点建立稳定、长期的DNAme和基因沉默。其反向系统CRISPRon则将dCas9与TET1（TETv4）融合，并利用修饰的sgRNA（携带MS2茎环）招募MCP-VPR转录激活复合物，实现强劲且持久的基因激活。
- •
紧凑型编辑平台：为解决传统dCas9融合蛋白过大、难以包装进腺相关病毒（AAV）等载体的难题，研究者开发了更小的替代平台。例如，OMEGAoff基于工程化的IscB核酸酶，dCasMINI和eCas12f1i则源自紧凑的Cas12f变体，它们尺寸更小，易于AAV递送。ZFP-EvoETR和CHARM系统则利用锌指蛋白（ZFP）等更小的DNA结合域，分别通过融合DNMT3A-3L-KRAB或招募内源性DNMT3A来实现高效沉默。
治疗应用前景广阔
靶向DNAme编辑在多种疾病领域展现出巨大的治疗潜力：
- 1.
逆转肿瘤发生：通过表观遗传重编程，可沉默致癌基因或重新激活抑癌基因。例如，使用dCas9-KRAB靶向沉默ZEB1基因，可逆转乳腺癌细胞的EMT（上皮-间质转化）程序，抑制转移。利用CRISPRoff沉默DNA修复基因MGMT，能使胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗重新敏感。反之，通过dCas9-TET1与转录激活因子组合（CRISPRa）可重新激活在肝癌等肿瘤中被沉默的多个抑癌基因。
- 2.
治疗代谢性疾病：肥胖等代谢疾病中存在“表观遗传记忆”，导致体重容易反弹。靶向编辑这种记忆有望实现长期体重控制。在临床前模型中，利用CRISPRoff在肝脏中持久抑制PCSK9基因表达，可有效降低低密度脂蛋白胆固醇水平，为治疗高胆固醇血症提供了新策略。
- 3.
干预衰老进程：衰老伴随着全基因组DNAme模式的规律性改变（表观遗传时钟）。初步研究表明，利用CRISPRoff靶向编辑年龄相关的CpG位点，可以影响衰老相关的表观遗传网络和转录组，为探索逆转细胞衰老的表观遗传疗法奠定了基础。
- 4.
对抗持续感染：针对如HIV-1和HBV等病毒，表观编辑提供了“阻断与锁定”策略，即通过诱导病毒基因组DNAme，使其永久沉默，防止再激活。目前已有针对HBV的疗法（如TUNE-401、CRMA-1001）进入早期临床试验阶段。在细菌中，利用CRISPRi（干扰）或未来的表观沉默工具靶向抗生素耐药基因，有望恢复细菌对抗生素的敏感性。
- 5.
挽救印记基因功能：对于Rett综合征（MECP2）、天使综合征（UBE3A）、脆性X综合征（FMR1）等由印记异常或基因沉默导致的疾病，通过dCas9-TET1对沉默的功能性等位基因进行靶向去甲基化，可重新激活其表达，在临床前模型中实现了神经元功能的挽救 。
- 6.
抑制异常激活的基因：在面肩肱型肌营养不良症（FSHD）中，异常表达的DUX4基因是致病元凶。基于dCas9MINI的表观沉默疗法EPI-321已进入I/II期临床试验。在特发性小纤维神经病（iSFN）中，利用ZFP抑制SCN9A基因表达以降低疼痛信号的疗法ST-503也正在进行临床评估。
临床转化的挑战与对策
尽管前景光明，但表观基因组编辑的临床转化仍面临多重挑战：
- •
染色质环境影响效率：编辑效果受靶位点CpG密度、局部染色质状态和细胞类型的影响很大。在非分裂细胞（如神经元）中建立持久的DNAme尤为困难。机器学习模型（如EpiCas-DL）和表观编辑图谱正在被开发，以预测和优化gRNA在不同细胞环境中的编辑效率。
- •
效应结构域的协同与持久性：持久调控需要合理组合效应域。例如，CRISPRoff中DNMT3A-3L与KRAB的协同确保了稳定的DNAme和异染色质形成。CHARM系统则通过DNMT3L结构域招募内源性DNMT3A，并利用未甲基化的H3尾巴缓解其自身抑制，实现长效沉默。对于基因激活，TET1与VPR等转录激活因子的组合（如CRISPRon）比单独使用TET1更有效。
- •
体内递送壁垒：大尺寸的dCas9融合蛋白超出AAV的包装容量。解决方案包括使用更小的DNA结合平台（如ZFP-EvoETR、dCasMINI、OMEGAoff）以及采用非病毒递送方式，如脂质纳米颗粒（LNP）递送mRNA。mRNA-LNP平台具有瞬时表达、免疫原性相对较低等优势，但也面临递送效率和组织靶向性的挑战。
- •
脱靶效应风险：gRNA的非特异性结合或效应结构域（如DNMT3A）的固有酶活可能导致非靶位点的表观遗传改变。通过优化gRNA设计算法（考虑染色质可及性等特征）、对效应域进行工程化改造以降低其非特异性DNA结合能力，以及采用瞬时递送策略，有助于降低脱靶风险。
结论
靶向DNA甲基化与羟甲基化的表观基因组编辑技术正在掀起一场治疗革命，为癌症、代谢性疾病、衰老、感染性疾病及遗传性疾病提供了前所未有的精准干预手段。尽管在编辑效率的语境依赖性、体内递送、脱靶效应和长期安全性方面仍需深入探索，但随着更精巧的编辑平台、智能化的设计工具和高效的递送系统不断涌现，这项技术有望克服现有疗法的局限，最终造福于目前缺乏有效治疗选择的广大患者。
