肽类是新兴的治疗方法，填补了小分子药物和抗体之间的空白1, 2。历史上，肽类药物是从天然存在的生物活性肽（如肽激素和肽类天然产物）开发而来的[3]。天然肽激素的结构由蛋白质生成氨基酸（pAAs）组成，这导致了较差的药代动力学特性，例如低代谢稳定性和有限的给药途径。因此，通常需要对这些分子进行结构修饰才能将其开发成治疗剂，例如已建立的胰岛素detemir和semaglutide等药物4, 5。另一方面，天然产物肽通常在侧链、主链甚至肽骨架方面包含各种非蛋白质生成结构[6]。这些结构特征不仅赋予了它们强大的生物活性，还赋予了有利的药代动力学特性，包括抗蛋白酶降解性和口服可用性。
除了偶然发现之外，从头靶向生物活性肽的发现最近越来越受到关注。高通量肽筛选技术的进步使得能够发现针对生物学相关蛋白质靶点的从头肽，包括以前无法成药的靶点[7]。通过代表性技术鉴定出了越来越多的肽候选物，包括化学合成的单珠单化合物库、DNA编码库（DELs）、肽和蛋白质的分裂-内含子环化以及肽展示方法8, 9, 10, 11, 12。在从头肽发现方法中，信使RNA（mRNA）展示技术以其巨大的库规模（通常超过1012个分子）而著称，这些分子来自随机模板mRNA 13, 14, 15。在体外重组系统中，通过mRNA模板翻译的帮助，非蛋白质生成构建块可以通过直接添加预酰基化的tRNA被整合到肽中，同时省略相应的占据密码子（图1a）。值得注意的是，杉博昭及其同事开发了随机非标准肽整合发现（RaPID）系统，该系统整合了体外遗传密码重编程和mRNA展示技术[16]。在RaPID系统中，通过弹性酶（flexizyme）制备的酰基-tRNA引入非蛋白质生成氨基酸（npAAs），这极大地增加了肽库的结构多样性[17]。RaPID系统的多功能性体现在其在快速简便地发现与药物开发相关的从头非标准肽方面的广泛应用。
技术进步，如RaPID系统和正交酰基-tRNA合成酶（ARSs），使得能够将各种非天然构建块整合到展示的肽中18, 19。这些包括，但不限于，N-甲基- [20]、N-烷基- [21]、β- [22, 23, 24]、γ- [25]、D-氨基酸26, 27，以及羟基28, 29、氨基羧酸[30]和氨基苯甲酸31, 32。尽管有这些发展，但由于两个主要挑战，通过mRNA展示可访问的化学空间仍然有限。首先，使用当前方法（如弹性酶、工程化的ARSs或化学合成）并不总能获得带有目标构建块的tRNA。例如，γ-氨基酸负载的tRNA会通过γ-氨基的亲核攻击迅速发生分子内内酰胺形成，除非γ-氨基被屏蔽[33]。其次，即使所需的酰基-tRNA可用，npAAs或其他修饰的整合也受到翻译机制本身的限制（图1b）。核糖体必须催化这些非天然构建块的缩合，而这往往成功率有限。虽然翻译起始可以容忍某些非天然构建块，如芳香族寡酰胺折叠体，但延伸过程则不那么宽容。尽管工程化核糖体偶尔能够实现特定npAAs的翻译，但其整合效率通常较低[34]。
克服这些挑战至关重要，因为扩展从头肽发现中的化学空间不仅扩大了可访问的序列多样性，还为靶肽配体赋予了更多类似药物的特性。虽然mRNA展示技术能够快速鉴定出针对治疗靶点的高亲和力肽配体，但所得肽通常需要广泛的结构优化，如MK-0616 [35]和zilucoplan [36]所示。为了解决这些限制，可以在翻译事件后对展示的肽进行化学和/或酶法衍生，以引入核糖体机制无法访问的非标准构建块和骨架结构。这些翻译后修饰（PTM）方法已成为核糖体整合的有希望的替代方案，提供了更大的化学空间（图1c）。将这些方法与体外展示结合使用，特别是能够编码npAAs的RaPID展示，可以在表型-基因型 conjugates格式下几乎无限地选择构建块，从而扩展化学多样性。除了mRNA和RaPID展示之外，这些方法还应用于核苷酸编码的质量库肽选择，包括噬菌体展示，以生成高度多样化的库11, 37, 38。在这篇综述中，我们总结了应用于mRNA展示的酶法、化学和协同PTM策略的最新进展，并讨论了与该平台整合的潜在新技术。
