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这篇综述系统地梳理了酶促核酸合成领域的最新突破，展现了酶从“遗传忠实守护者”转变为“可编程分子发明工具”的范式革新。作者聚焦“模板依赖”与“模板无关”两大合成策略，深入探讨了酶如何突破进化限制，实现非经典修饰核苷酸的高效掺入。文章不仅总结了聚合酶、连接酶工程化的关键进展，还强调了其在规模化生产治疗性寡核苷酸、探索替代遗传系统(XNAs)及将化学功能编码入信息聚合物等方面的广阔应用前景，为化学生物学、治疗学和分子设计提供了全新视角。
引言
酶曾长期被视作遗传保真性的守护者，其核心任务是复制与修复，创新则属于化学合成的范畴。然而，这一界限正被打破。如今，酶已成为构建远超经典遗传系统（DNA/RNA）范围之外的核酸的强大可编程催化剂。它们不仅能接受带有庞大疏水基团、电荷、糖基、氨基酸侧链类似物及非天然糖的底物，还能在严苛条件下组装深度修饰的核酸链。这一范式转变，使得酶促合成能够大规模生产治疗性寡核苷酸，探索替代性遗传系统，并将化学功能直接编码到信息聚合物中。
模板依赖酶促合成
聚合酶介导的模板依赖合成
模板依赖合成是获得序列确定核酸最成熟的酶学途径。互补碱基配对提供了内在的序列控制和纠错机制。工程化聚合酶，如KOD XL和Vent (-exo)，现已能够在不影响保真度的情况下，高效掺入带有疏水性、带电、糖基化及类氨基酸侧链等多种修饰的核苷酸，合成长度可达150个核苷酸的超修饰DNA链。这些寡核苷酸表现出改变的双链稳定性、增强的核酸酶抗性和可调的生物物理性质。
修饰范围已从简单的取代基扩展到碳水化合物基团和完整的氨基酸侧链模拟物。KOD XL、Vent (exo–)和Pwo等聚合酶能够耐受同一链内的多个糖基化dNTPs，实现可进行多价凝集素结合的糖基化DNA的合成。同样，带有羟基、羧酸根、咪唑和含硫侧链的核苷酸也能被酶促掺入，尽管硫醇修饰的底物催化效率常会降低。
这些方法正用于探索修饰核酸的生物学意义。直接编码在DNA模板中的化学信息可以主动调控转录输出：系统性地掺入表观遗传和非天然修饰的嘧啶显示了对T7 RNA聚合酶活性的强烈、位置依赖性影响，其中某些尿嘧啶衍生物（最显著的是5-氰基甲基尿嘧啶）出人意料地增强了RNA合成。TGK及其相关工程化DNA聚合酶也被用于实现含有多个核碱基修饰rNTPs的RNA的模板依赖合成。最近的定向进化工作进一步扩展了这一范式，实现了在模板控制下持续、长链RNA的高保真（>99%）高速率合成，同时可耐受特定的2'-和碱基修饰的核糖核苷酸。
模板依赖合成在处理糖和骨架修饰方面也表现出色。工程化聚合酶，如源自Taq DNA聚合酶Stoffel片段的SFM5-7，对2'-O-甲基和2'-氟核酸表现出高活性，并支持RNA与XNA（非天然核酸）之间的合成、逆转录和转录转换。与多种XNA的兼容性已被用于开发固相、自引发酶促平台，通过聚合酶延伸、位点特异性切割和模板酶促再生的循环，可持续合成2'-F、2'-OMe、FANA和嵌合XNA。此外，在引物延伸反应中添加多胺可进一步稳定弱配对的XNA-DNA双链体，从而在不牺牲保真度的情况下高效合成阿拉伯核酸(ANA)等XNA骨架。苏糖核酸(TNA)与进化聚合酶（如KOD-RSGA）配对，可掺入庞大的疏水碱基甚至非天然碱基对，以扩展信息存储。
通过对古菌B家族DNA聚合酶中新生链空间门的合理工程，实现了对长链（长达750 nt）、完全2'-O-甲基和2'-O-(2-甲氧基乙基)-RNA聚合物的高效模板依赖合成。所得聚合酶2M在N40模板上合成2'-OMe和2'-MOE的产率分别高达90%和65%，同时保持高保真度，从而解锁了先前酶学方法无法获得的完全2'-修饰的RNA催化剂和混合化学适体的体外进化。类似的空间门和环路重塑策略可推广至其他DNA聚合酶，用于位置特异性合成长链、深度修饰的RNA。最近，工程化XNA聚合酶被用于合成同时含有2'-叠氮和2'-氟修饰的混合XNA聚合物。这些嵌合遗传聚合物可使用商业DNA聚合酶在一锅反应中被高效逆转录并扩增回DNA，其保真度堪比领先的XNA系统。
连接酶介导的模板依赖合成
连接酶介导的模板依赖合成提供了绕过聚合酶底物限制的正交策略。连接酶催化的寡核苷酸聚合(LOOPER)利用T3和T4 DNA连接酶，在连接短寡核苷酸片段时，能够耐受广泛的糖、核碱基和磷酸骨架修饰，从而可以从预功能化的模块组装长链修饰核酸。此方法已被用于合成具有高产量和高纯度的完全磷酸硫代修饰的反义寡核苷酸。更复杂的连接策略依赖于动力学锁定或分段DNA组装，允许一锅法构建长达千碱基的、带有位点特异性表观遗传修饰、荧光团和化学柄的单链DNA。连接酶还可被重新用作类转录催化剂。LOOPER支持DNA模板化的XNA聚合物合成，同时保持超过95%的保真度，并支持双向信息流，允许从XNA模板再生DNA。
另一项规避单核苷酸底物限制的策略是使用人工核苷酸密码子，其中，硫代磷酸稳定的三核苷酸三磷酸盐可作为多碱基单元，在模板控制下被DNA聚合酶高效掺入，从而实现快速链延伸，同时耐受LNA和骨架修饰。核酶则提供了一个在益生条件下利用RNA三核苷酸三磷酸盐进行模板依赖聚合的范例。三联体聚合酶核酶在冻融和pH循环中催化RNA复制，支持无引物起始、序列进化和自我复制。
集成与多酶模板依赖工作流程
模板依赖合成已通过工艺集成走向成熟。多酶级联反应现在能够在单次操作中生产临床相关的寡核苷酸。Almac的BOOST平台利用工程化dsRNA连接酶顺序连接短“区块”并耦联原位磷酸化，合成了完全修饰的siRNA，其浓度达到毫摩尔级别，纯度超过98%。类似地，基于自引发模板和位点特异性切割的恒温酶促合成平台已被建立。利用涉及KOD聚合酶和EndoV核酸内切酶的双酶系统，可大规模制备立体化学纯的磷酸硫代寡核苷酸，其分离产率与亚磷酰胺化学法相当。另一项名为MEGAA（模板引导扩增子组装的突变）的混合聚合酶-连接酶工作流程，可通过尿嘧啶编码模板、寡核苷酸指导的缺口填补和连接，从单个种子序列生成千碱基尺度的DNA变体文库，实现高效、自动化的深度突变基因库构建。最近还报道了一种酶促条形码选择策略，使用可逆和不可逆的链终止剂进行循环单核苷酸延伸，从复杂文库中选择性延伸和回收特定寡核苷酸子集，实现了高富集度和低材料损耗。
模板无关酶促合成
基于末端转移酶的模板无关合成
模板无关酶促合成将聚合物生长与预存模板解耦，转而依赖酶工程、底物设计和可控反应循环。该范式的核心是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其无需模板即可在DNA的3'端添加核苷酸的内在能力已被广泛优化用于合成目的。对来自不同脊椎动物的TdT的比较分析揭示了显著的活性差异，其中禽类TdT表现出特别高的聚合速率。对这些酶的结构导向诱变得到了活性显著增强的变体，可高效掺入3'-封闭的核苷酸，实现高达10个循环的可控、单核苷酸掺入。定向进化进一步优化了TdT的合成应用。诸如TdT-33的变体可耐受3'-磷酸dNTPs并在较高温度下工作。其他工程化TdT，如MTdT-evo，可高效掺入2'-修饰核苷酸，并支持通过点击化学在XNA链的3'端进行合成后功能化。
模板无关合成已通过工程化非经典RNA聚合酶扩展到RNA领域。CID1 PolyU聚合酶的突变变体能够使用3'-O-烯丙基封闭的rNTPs进行N+1延伸，然后进行钯催化的脱保护，实现平均单步效率达95%的N+10寡核苷酸多循环RNA合成。该平台可容纳2'-修饰的XNA和用于缀合的末端功能柄。替代的封闭策略也已被探索，例如带有醚或酯基的3'-O-保护的LNA和RNA核苷酸可作为TdT或Poly(U)聚合酶介导反应中的瞬时链终止剂。
程序化与空间可控的模板无关合成
空间分辨的模板无关合成已通过喷墨打印技术实现。通过将皮升级的含TdT试剂沉积到固定的引物上，台式酶促DNA合成平台可以生成具有微米级分辨率和高序列保真度的多重微阵列。此类方法预示了可用于诊断、数据存储和生物传感的分布式、按需核酸合成。
模板无关酶促合成还能构建具有增强性能的杂交核酸。TdT介导的TNA核苷酸在DNA引物上的“加尾”，产生了嵌合DNA-TNA构建体，其表现出增强的抗外切核酸酶能力和在生物环境中改善的稳定性。这些嵌合体可被整合到DNA折纸纳米结构中，在血清中具有更长的寿命。同样，非模板加尾策略可与连接结合，在特定位置插入单个非天然碱基对，从而构建与纳米孔测序兼容的12字母遗传系统。
展望
文中综述的进展表明，酶促核酸合成在概念上已达到成熟阶段。核心问题不再是酶是否能耐受非经典化学，而是如何有目的、可预测地利用这种耐受性。聚合酶和连接酶证明，只要能量和几何约束得到妥善管理，序列信息和化学功能是可以兼容的。
悬而未决的是集成与范围的问题。酶促合成在选择性、立体化学控制和生物相容性方面表现出色，但仍缺乏普适性。并非所有修饰都得到同等程度的耐受，并非所有序列都同等可及，也并非所有工作流程都同等可扩展。这些局限性是分子水平精准合成所固有的；更有趣的挑战是如何将它们组合成可靠的系统，而不仅仅是宽容的系统。
未来的进展更可能来自于杂交而非取代。模板依赖和模板无关策略将越来越多地在单一工作流程中结合，将酶促合成用作一系列逻辑连接的步骤，而非单一整体过程。持续的酶定向进化，在清晰阐明的合成目标而非模仿自然的指导下，将进一步模糊“生物学上合理”与“化学上可能”之间的界限。
