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镰刀型细胞贫血症小鼠模型通过优化骨髓移植和慢病毒载体携带的β-珠蛋白基因治疗，显著改善贫血指标及器官损伤，为基因治疗临床转化提供依据。
杰弗里·梅丁（Jeffrey Medin）|特蕾莎·A·德卢吉（Theresa A. Dlugi）|朱莉安娜·阿尔瓦雷斯-阿戈特（Juliana Alvarez-Argote）|特蕾莎·桑达拉拉詹（Teresa Sundararajan）|吉特卡·雷博娃（Jitka Rybova）|王学军（Xuejun Wang）|玛丽·法伯（Mary Faber）|威廉·麦基洛普（William McKillop）
威斯康星医学院（Medical College of Wisconsin）
摘要
镰状细胞病（SCD）影响了大约10万美国人，其中非洲裔和西班牙裔美国人的发病率更高。尽管目前有标准的治疗方法，但SCD患者的生活质量较低，预期寿命比普通人群短20年。由于缺乏匹配的供体、移植物抗宿主病风险、移植物排斥反应以及患者的高健康要求，同种异体造血干细胞移植（HSCT）等根治性方法的应用受到限制。Townes SCD小鼠模型在临床前研究中非常有用，它们能够模拟人类的SCD症状，表现为严重的贫血、器官损伤和早期死亡。我们测试了一种使用慢病毒（LV）载体的基因疗法，该载体携带含有三种抗镰状变性的β-珠蛋白转基因。这些基因通过转导来自纯合镰状血红蛋白（SS）Townes小鼠的骨髓细胞并移植到SS受体小鼠体内来实现治疗。我们通过增加LV剂量、每个受体的细胞数量以及移植后的输血来优化这种移植方法。通过功能检测评估了受体的恢复情况和基因疗法的效果。与非治疗组相比，我们观察到血红蛋白和红细胞比容计数值有所改善，红细胞镰状变性减少，心脏、肺、脾脏和肾脏的疾病相关病理状况也有所好转。这种方法为未来SCD的基因疗法临床前研究奠定了基础。
引言
镰状细胞病（SCD）影响了近10万美国人，是美国最常见的单基因血液疾病[1]。正常成年人的血红蛋白（HbA）由2个α-珠蛋白亚基和2个β-珠蛋白亚基组成。全球约有5%的人携带突变的β-珠蛋白基因，这通常会导致SCD或地中海贫血[2]。当β-珠蛋白基因的第六个密码子发生A到T的突变时，会导致谷氨酸被缬氨酸取代，从而引发SCD。含有突变镰状β-珠蛋白（HbS）的血红蛋白四聚体会在缺氧条件下使红细胞（RBC）聚集成僵硬的镰刀形状。这一过程会导致血管阻塞事件（VOEs）和炎症变化，引发急性疼痛危机和器官损伤。最终，SCD患者的生活质量较差，寿命比普通人群缩短约20年[3]。
目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的SCD治疗方法主要包括姑息性和细胞疗法。姑息性疗法中，羟基脲（hydroxyurea）用于增加胎儿血红蛋白（HbF）的水平，因为成人体内的HbF含量较低；HbF可以与HbS竞争，从而抑制红细胞的镰状变性[4]；然而，这种方法由于患者依从性低（包括对药物的抵触、缺乏教育以及对不良反应的担忧）而受到限制[4, [5], [6]。另一种姑息性疗法是输血，患者通过输注健康个体的红细胞来缓解贫血和血管阻塞相关并发症；但这种方法存在同种免疫反应风险以及其他急性和慢性输血相关不良反应[7,8]。同种异体造血干细胞移植（HSCT）是一种根治性方法，但由于供体数量有限，且存在显著的移植物抗宿主病（GVHD）、感染和死亡风险[9]。
2023年12月，FDA批准了两种适用于12岁及以上SCD患者的基因疗法[10]：Lyfgenia和Casgevy。Lyfgenia是一种慢病毒载体（LV）疗法，通过改造造血干细胞（HSCs）使其产生抗镰状变性的血红蛋白（HbAT87Q[11]；Casgevy是一种基于CRISPR-Cas9的基因编辑疗法[12]，可增加HbF的产生。这两种疗法都涉及对自体HSCs的体外改造，然后在清髓处理后以单次剂量重新输注给患者，作为HSCT的一部分。
尽管SCD治疗方法有所进展，但进一步改进治疗仍然至关重要，尤其是为了提高治疗的可及性和患者的适用范围。Lyfgenia和Casgevy的费用分别为每位患者约300万美元和200万美元[13], [14], [15]。值得注意的是，同种异体HSCT虽然成本较低（约20万至50万美元[16,17]），但HLA匹配供体数量有限，并且存在移植物抗宿主病和移植物排斥的风险[18]。
目前有两种广泛使用的SCD小鼠模型：Townes[19]和Berkeley[20]模型。这两种模型都表现出人类SCD的特征，包括严重贫血、网织红细胞增多、肝脏、心脏和肺功能异常以及早期死亡。然而，Townes模型更接近人类疾病，因为出生时表达人类γ-珠蛋白，随后在出生后第一个月内逐渐被β-珠蛋白取代[19]。此外，Berkeley小鼠更容易出现并发症，对骨髓移植（BMT）等手术的耐受性较差[20]。临床前基因疗法研究通常使用这两种模型，但转导后的细胞通常被输注到经过致死辐照的野生型BL6/J受体小鼠体内，可能是因为SCD小鼠对移植手术的耐受性较低[21], [22], [23]。我们之前使用多种临床可转化的检测方法对Townes SCD模型进行了详细研究[24]。我们还开发了一种表达治疗性β-珠蛋白（LV/hβAS3-globin）的慢病毒载体，该载体含有三种减少红细胞镰状变性的突变[23,25,26]，并建立了一种基于质谱（MS）的方法来定量β-珠蛋白[27]。在这里，我们使用来自Townes SS小鼠的LV改造骨髓细胞（BMCs）对Townes SS受体进行同种移植，以优化小鼠BMT程序。这种同种移植更接近临床基因疗法的实施方式，即使用自体细胞进行转导和重新输注。我们还在移植后长期跟踪观察受体小鼠，通过多种功能检测评估器官功能，未观察到任何不良反应，并证明了我们优化后的基因疗法的有效性。
研究部分
小鼠和研究组
我们从杰克逊实验室（Jackson Laboratories，JAX stock #01307，位于缅因州巴港，Bar Harbor）获得了纯合HbS（SS）、纯合HbA（AA）和杂合HbA和HbS（AS）的Townes SCD小鼠，或者自行繁殖这些小鼠。所有动物实验均获得了威斯康星州密尔沃基市MCW机构动物护理和使用委员会（AUA00005418）的批准。每组实验包含4-5只小鼠（每性别）。所有受体小鼠年龄在2-4个月之间，供体小鼠年龄在1.4-4个月之间。
基因治疗后Townes SCD小鼠的早期死亡率较高
基于慢病毒的SCD基因疗法已经开发出来，并正在进行临床前和临床研究[37,38]。我们的LV/hβAS3-globin载体基于hβAS3-globin结构（图1 A）[22,39]。在我们手中，这种载体的生产滴度稳定在6×108 IU/mL（数据未显示）。为了测试LV/hβAS3-globin基因疗法的效果，我们进行了初步实验，将来自SS Townes小鼠的转导供体BMCs移植到SS Townes受体小鼠体内
讨论与结论
如上所述，FDA已批准两种用于SCD的基因疗法：Lyfgenia和Casgevy。莱昂纳德（Leonard）和坎特（Kanter）在2025年12月发表了比较这两种疗法的论文[40]。他们发现，在两项试验中，目标细胞的动员都较为困难，但后者由于基础编辑过程中的细胞损失更大而效果更显著。
资金来源
该项目得到了Carragher家族基金和Myers家族基金的慷慨资助。该项目还得到了Midwest Athletes Against Childhood Cancer Fund, Inc.（MACC Fund）和Greater Milwaukee Foundation（GMF）Russell J. and Betty Jane Shaw Fund的支持。此外，还获得了MCW的Research and Education Initiative Fund的支持，该基金隶属于Advancing a Healthier Wisconsin Endowment项目。
数据可用性
本文中的数据可以在文章和补充材料中找到，或根据需要向通讯作者索取。
