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这篇综述系统性地梳理了CAR-T细胞疗法面临的关键挑战——回输细胞在体内持久性不足，并聚焦于通过优化制造工艺来克服该难题。文章核心观点指出，富集低分化记忆T细胞（如TSCM、TCM）亚群，或通过调控信号通路、重塑表观遗传、调节代谢来延缓其终末分化，能够显著提升CAR-T细胞的长期存续和抗肿瘤疗效。全文围绕起始细胞源选择、刺激、基因修饰、扩增四个制造步骤，详细评述了当前与新兴的策略，为开发个性化、高效能的CAR-T产品提供了全面的制造学视角。
制造延长CAR-T细胞持久性的策略
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法革新了血液系统恶性肿瘤的治疗格局，然而，回输的CAR-T细胞在患者体内的持久性有限，这主要归因于T细胞耗竭和终末分化，是影响长期疗效的主要障碍。近期研究表明，与常规产品相比，富含低分化记忆T细胞亚群（如干细胞样记忆T细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（TCM））的CAR-T细胞产品，在体内表现出更优的扩增、更长的持久性、更强的细胞毒性以及更好的临床结果。为了在制造过程中富集这些低分化记忆T细胞，研究者们探索了多种策略。
T细胞亚群
T细胞根据分化阶段具有异质性。初始T（TN）细胞在抗原刺激后分化为效应T（TEFF）细胞或记忆T细胞。记忆T细胞亚群遵循等级分化过程：TN细胞依次分化为TSCM、TCM、效应记忆T（TEM）细胞，最终成为TEFF细胞。低分化记忆T细胞（如TN、TSCM）主要依赖氧化代谢维持静息、自我更新和长期持久性；而分化的T细胞（如TEM、TEFF）则转向糖酵解和谷氨酰胺分解，以实现快速增殖和抗肿瘤活性，但自我更新能力较弱。这些亚群可通过表面标志物如CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、CD27等加以区分。
CAR-T细胞的制造方法
CAR-T细胞的制造主要包括四个步骤：T细胞分离、刺激、基因修饰和体外扩增。每个步骤都会影响T细胞的分化。
起始细胞来源
目前所有FDA批准的CAR-T细胞均来自自体外周血T细胞。然而，患者年龄、疾病类型和既往治疗（如化疗）会影响起始T细胞的组成和功能适应性。为保存低分化记忆T细胞，建议在化疗前或治疗早期采集T细胞用于制造。
同种异体外周血T细胞是另一个重要来源。来自健康供体的T细胞可以产生含有生理性保存的低分化记忆T细胞的高质量CAR-T细胞，但面临移植物抗宿主病（GvHD）和宿主免疫排斥的风险。通过选择病毒特异性记忆T细胞或利用基因编辑技术敲除T细胞受体（TCR）和人类白细胞抗原（HLA）分子，可以降低这些风险。
其他有潜力的细胞来源包括脐带血（UCB）和多能干细胞（PSC）。UCB来源的CAR-T细胞主要是未接触过抗原的TN细胞亚群，具有持久存续潜力且GvHD风险较低。PSC（包括诱导多能干细胞（iPSC））具有自我更新和多能性，可分化成T细胞，其衍生的CAR-T细胞通常类似TN细胞，但存在恶性转化等安全担忧。
细胞类型
常规制造使用从白细胞分离术产物中获得的外周血单个核细胞（PBMC）中的“批量”T细胞，其亚群比例不可控。为提高疗效，可对CD4+和CD8+T细胞进行分别分离、制造，并按预定比例（如1:1）重新组合。此外，从起始细胞源中去除抑制性的调节性T（Treg）细胞，可以改善CAR-T细胞的抗肿瘤功效。
最直接的策略是直接从白细胞分离术产物中富集记忆T细胞。例如，去除CD45RA+细胞后分选CD62L+细胞，可富集TCM和TEM亚群。分选CD4+/CD8+/CD62L+/CD45RA+细胞则可富集TSCM和TN细胞，在临床前模型中显示出更持久的存续和更强的抗肿瘤活性。
刺激方法
常规制造中，T细胞在基因转导前或后会受到刺激（如抗CD3/CD28抗体）以促进扩增，但这也会驱动T细胞向后期分化。为阻止分化，已开发出避免T细胞刺激的方法。
细胞因子信号通路在T细胞刺激、扩增和分化中起关键作用。白细胞介素-2（IL-2）虽常用，但会促进向TEFF和终末分化T（TTE）细胞的分化，并可能扩增Treg细胞。为富集低分化记忆T细胞，替代方案是使用IL-7和IL-15的组合，它们支持初始和记忆T细胞的稳态扩增，并通过降低哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR1）活性来帮助保存TSCM细胞。添加IL-21可进一步提高转导效率并保存低分化T细胞。
T细胞的基因修饰
基因递送方法
CAR基因主要通过病毒载体（γ-逆转录病毒、慢病毒）或非病毒载体系统（如转座子）导入T细胞。两者均将CAR基因半随机整合到宿主基因组中，存在插入突变风险。使用自失活载体或通过锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、规律成簇间隔短回文重复序列及相关蛋白（CRISPR/Cas）等基因编辑技术实现位点特异性整合，可以降低风险。
另一种方法是通过电穿孔或脂质纳米颗粒（LNP）以mRNA形式导入CAR基因，实现CAR的瞬时表达。这种瞬时性虽需重复给药，但可能有助于限制T细胞分化和耗竭。
基因插入
修改CAR设计也可增强持久性。例如，使用低亲和力的抗原识别域、选择4-1BB（而非CD28）作为共刺激分子、或将CD28共刺激域中的YMNM基序改为YMFM以减少核因子激活的T细胞胞浆蛋白（NFAT）的过度激活，均可延缓分化、增强存续。在CAR中引入信号转导和转录激活因子3（STAT3）结合基序和IL-2Rβ胞内结构域也能增强持久性。
CAR的表达即使在没有靶抗原的情况下也会引发“强直信号”，促进体外培养期间的分化。为解决此问题，已开发出可由小分子（如雷帕霉素、来那度胺）或合成Notch（synNotch）系统控制的“开关”型CAR，以增强持久性。
利用基因编辑技术将CAR基因定点整合到特定基因座（如T细胞受体α链基因座（TRAC）），可由内源性启动子调控CAR表达，显著减少强直信号，延缓分化和耗竭。
基因编辑
应用基因编辑技术敲除与过度刺激、耗竭或免疫抑制相关的基因，是热门研究方向。例如，敲除免疫检查点基因（如程序性死亡受体-1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4））、Treg相关基因（如叉头框蛋白P3（FOXP3））、或凋亡相关基因FAS，可增强CAR-T细胞功能。全基因组CRISPR/Cas9筛选还发现了如RASA2、RHOG、SNX9等新靶点，其敲除可增强体内持久性。
表观遗传重编程是另一有前景的策略。敲除关键表观遗传调节因子（如TET2、PRDM1、DNMT3A）可防止T细胞终末分化和耗竭，保存记忆T细胞亚群。
扩增
优化的培养条件
CAR-T细胞通常在添加细胞因子的培养基中培养一至两周以达到输注所需数量。但长时间培养、过度增殖或次优条件会促进终末分化和耗竭。使用集成细胞与培养条件监测的自动化生物反应器，以及利用人工智能（AI）技术优化细胞密度、pH、葡萄糖、乳酸等参数，可以生产出更高质量、持久性更好的CAR-T细胞。
代谢调节
低分化记忆T细胞主要依赖氧化代谢，而分化的T细胞依赖糖酵解。因此，调节T细胞代谢的策略被广泛探索。例如，限制培养基中的葡萄糖或使用蛋白激酶B（AKT）抑制剂抑制糖酵解，可以富集记忆T细胞。调节线粒体丙酮酸载体（MPC）等营养转运蛋白也能促进TSCM细胞的富集。
信号通路的药理学调节
在培养期间通过药物抑制CAR表达引发的激活信号通路，可减轻T细胞分化。例如，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路（使用艾代拉里斯等PI3K抑制剂或AKT抑制剂）或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路（使用雷帕霉素），可富集TCM/TSCM细胞并增强抗肿瘤活性。抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路（使用MEK1/2抑制剂）或达沙替尼（一种靶向上游激酶的酪氨酸激酶抑制剂）也显示类似效果。激活Wnt/β-连环蛋白信号通路（通过补充WNT3A或糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抑制剂TWS119）同样可增加TSCM/TCM细胞并增强疗效。
表观遗传的药理学调节
在体外培养期间添加小分子抑制剂进行表观遗传重塑，可防止分化为TTE细胞和T细胞耗竭。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如西达本胺）、组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂（如G9a/GLP抑制剂）、DNA甲基转移酶抑制剂（如地西他滨、他泽司他）等，在临床前模型中均显示出保存记忆T细胞、延长持久性和增强抗肿瘤活性的潜力。
短期扩增
随着病毒载体技术的进步，现在可以在3-5天甚至24小时内生产出CAR-T细胞。短期生产能最大程度减少体外培养期间的分化和耗竭。初步临床研究表明，与常规方案相比，短期扩增方案产生的CAR-T细胞在体内具有更好的扩增、更长的持久性和强大的抗肿瘤功能，且最终产品中保留了更多的TSCM和TCM细胞。
体内转导
体内转导技术是一种吸引人的新策略，可在患者体内直接生成CAR-T细胞，无需体外制造。当前方法可分为病毒载体基和纳米颗粒基两种。一种潜在方法是设计靶向低分化T细胞表面蛋白（如CD62L）的慢病毒载体，将CAR基因整合到这些长寿命T细胞亚群中，可能实现CAR的长期表达。另一方法则使用携带CAR-mRNA的靶向纳米颗粒，实现CAR的瞬时表达，可能有助于减轻与强直信号相关的耗竭，但需要重复给药。
结论
CAR-T细胞的持久性对于持续疗效至关重要。为了增强持久性，在整个制造过程（分离、刺激、基因修饰、扩增）中已开发出多种策略，旨在选择低分化记忆T细胞或延缓T细胞分化。这些效果主要通过调节信号通路、表观遗传重塑和代谢调控实现。值得注意的是，有研究表明，有效的CAR-T细胞产品可能需要分化与低分化记忆T细胞的平衡组合以达到最佳疗效。输注后，第一波扩增主要来自更分化的TEFF细胞，而第二波则来自TSCM/TCM等低分化记忆T细胞克隆。最佳比例可能因疾病类型、肿瘤负荷等因素而异。未来的研究需要确定特定条件下CAR-T细胞产品中T细胞亚群的最佳组成，从而为每位患者量身定制具有理想细胞组成的个性化CAR-T细胞产品，最大化CAR-T细胞疗法的疗效。
