TRPV4依赖的PI3K–Akt信号通路激活介导了高渗应激引起的细胞收缩以及管状上皮细胞中肌成纤维细胞的分化过程

高渗应力通过激活TRPV4通道介导的PI3K-Akt通路，诱导肾小管上皮细胞收缩及α-SMA阳性肌成纤维细胞分化。通过药物筛选和RNA测序，发现TRPV4拮抗剂抑制细胞收缩并阻断下游信号，同时差异基因富集于PI3K-Akt通路，证实该通路在连接机械信号与纤维化表型中的核心作用。

　　

宫野隆（Takashi Miyano）| 坂本直也（Naoya Sakamoto）| 塞拉俊宏（Toshihiro Sera）

日本东京理科大学医学与机器人工程设计系

摘要

管状上皮细胞周围的渗透环境会发生剧烈波动。我们发现，持续的高渗应力会诱导上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition），并且由高渗应力引起的细胞收缩对于这些细胞分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的肌成纤维细胞（myofibroblasts）至关重要。然而，高渗应力引起的细胞收缩与上皮细胞分化为α-SMA阳性肌成纤维细胞之间的机制尚不清楚。为了阐明NRK-52E细胞在高渗条件下的收缩机制，我们进行了针对机械敏感受体调节剂的靶向药理学筛选，发现瞬时受体电位香草酸类4（TRPV4）通道拮抗剂（HC-067047、RN-1665和GSK205）能够有效抑制细胞在200 mM甘露醇作用下的收缩，从而表明TRPV4是关键的机械感受器。我们通过RNA测序分析了高渗应力下的基因表达情况，并利用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的通路富集分析方法，识别出3,137个差异表达基因（调整后的p值<0.05，|log₂FC| > 1），其中这些基因在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路中的富集程度最高。最后，为了将机械感受器与这一通路联系起来，我们重点研究了TRPV4和PI3K–Akt信号通路。高渗应力增加了Akt的磷酸化水平，而TRPV4的抑制可以降低这种磷酸化。TRPV4或PI3K的抑制还减少了α-SMA的表达，并减弱了与细胞外基质相关的基因上调，表明TRPV4介导的PI3K–Akt通路激活驱动了α-SMA阳性肌成纤维细胞的分化。综上所述，药理学和转录组学分析共同表明，TRPV4依赖的PI3K–Akt激活是渗透应力诱导的细胞收缩和肌成纤维细胞分化的核心机制。

引言

肾小管上皮细胞持续暴露于渗透压的波动中，这是其生理环境的基本特征。在持续的高渗应力下，这些细胞会发生上皮-间充质转化（EMT），转变为表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的肌成纤维细胞，从而导致小管间质纤维化和肾功能障碍[1]、[2]。我们之前的研究表明，高渗应力诱导的细胞收缩是EMT的早期触发因素，将短暂的形态学收缩与长期的表型重编程联系起来[3]。然而，高渗应力与细胞收缩以及随后分化为α-SMA阳性肌成纤维细胞之间的分子机制仍不甚明了。尽管钙内流和机械信号传导已被认为与渗透适应有关[4]，但这些事件如何协同作用以驱动纤维化转变尚未明确。

细胞对高渗应力的反应，包括细胞形状和体积的变化，在不同细胞类型间存在显著差异[5]、[6]、[7]。在肾小管上皮细胞中，暴露于200 mM甘露醇等高渗介质会导致细胞表面积和细胞体积显著减小[3]、[8]、[9]。这些体积变化通常归因于通过水通道蛋白（aquaporins）的快速水分外流[10]。然而，越来越多的证据表明，机械敏感离子通道在检测和转导渗透刺激中也起着关键作用[11]。瞬时受体电位（TRP）通道作为关键的渗透感受器已被发现，它们在膜张力变化时介导Ca²⁺的内流和下游信号级联反应[12]、[13]。虽然TRP通道已被证实参与渗透感知[14]，但它们在高渗应力诱导的细胞收缩中的具体作用仍不明确。

本研究旨在阐明高渗应力如何触发细胞收缩并促进肾小管上皮细胞向α-SMA阳性肌成纤维细胞的转化。为此，我们采用了两种互补策略：首先进行靶向药理学筛选，以识别高渗应力诱导的收缩抑制剂；其次通过RNA测序来明确涉及的信号通路。实验结果表明，TRPV4是关键的机械感受器，而PI3K–Akt通路是下游细胞骨架和转录反应的关键介质。

实验部分

细胞培养

大鼠近端小管上皮细胞（NRK-52E）来自日本研究生物资源细胞库（大阪）。细胞培养使用Dulbecco改良的Eagle培养基（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），并添加了5%的胎牛血清（FBS，BioWest，法国努阿耶）和1%的青霉素-链霉素（Nacalai Tesque，京都）。培养条件为37°C、5% CO₂和可控湿度。

试剂

甘露醇（Nacalai Tesque），HC-067047（Abcam）

识别抑制NRK-52E细胞高渗应力诱导收缩的化合物

我们评估了与机械感受器相关的化合物对NRK-52E细胞高渗应力诱导收缩的抑制作用。

在功能性实验之前，我们使用WST-8活力测定法评估了化合物的细胞毒性。虽然在1 μM浓度下处理24小时后，所有测试的化合物均未影响细胞增殖（补充图1A），但有三种化合物（化合物编号5、34和64）在10 μM浓度下显著抑制了细胞增殖（补充图1B）。

为了建立可靠的实验方法

讨论

本研究旨在阐明高渗应力如何诱导肾小管上皮细胞的收缩，重点关注机械敏感受体的作用。药理学筛选结果显示，TRPV4拮抗剂是高渗应力诱导收缩的强效抑制剂，表明TRPV4是关键介质。转录组和生化分析表明，高渗应力激活了PI3K–Akt信号通路，而TRPV4的抑制可以减弱这一通路的作用。

结论

综上所述，药理学筛选和RNA测序结果表明，TRPV4通道驱动高渗应力引起的细胞骨架收缩，并激活NRK-52E细胞中的PI3K–Akt通路。该通路还促进了高渗应力下α-SMA阳性肌成纤维细胞的出现，将早期的机械信号与纤维化细胞变化联系起来。因此，TRPV4–PI3K–Akt信号通路构成了上皮细胞对高渗适应的核心机械化学轴。

作者贡献声明

塞拉俊宏（Toshihiro Sera）：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。宫野隆（Takashi Miyano）：撰写 – 审稿与编辑，原始稿撰写，方法学设计，实验实施，资金获取，概念构思。坂本直也（Naoya Sakamoto）：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

本研究生成的RNA-seq数据已存储在日本DNA数据库（DDBJ）的序列读取存档（SRA）中，BioProject编号为PRJDB37966，Run编号为DRR792290（miyanot-0001_Run_0001）。这些数据可在此网址公开下载：https://www.ddbj.nig.ac.jp/

资助

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究资助（项目编号23K11831、24K23059、25K21564）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢东京理科大学先进工程学院的菊池昭彦（Akihiko Kikuchi）博士、上村雅夫（Masao Kamimura）博士和梅泽政和（Masakazu Umezawa）博士在生物技术支持方面的帮助，包括提供荧光显微镜、分光光度计和qPCR设备。同时，我们也感谢东京理科大学药学系的西川真纪也（Makiya Nishikawa）博士和板仓祥子（Shoko Itakura）博士在生物技术支持（Western blotting实验）方面的协助。此外，我们还要感谢Editage公司（//www.editage.jp）的支持。