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糖尿病创面愈合机制及CD73+ ADMSCs治疗作用研究，发现CD73通过调控HIF-1α/VEGFA和PI3K/Akt信号通路改善糖尿病小鼠血管内皮功能障碍，促进创面愈合。
侯慧芳|张大|王松|郑妙云|白新阳|王国东|徐新慧|郭志坤|李宗金|李琼
河南医科大学基础医学科学院，新乡453003，中国
摘要
糖尿病伤口愈合仍然是一个重大的临床挑战。尽管基于间充质干细胞（MSCs）的疗法已被证明是解决这一问题的有希望的策略，但CD73表达对MSCs治疗潜力的具体贡献尚未被探索。在这项研究中，我们探讨了CD73表达在人脂肪组织来源的间充质干细胞（hADMSCs）治疗糖尿病压疮小鼠模型中的作用。我们的发现表明，CD73阳性的hADMSCs（CD73+hADMSCs）可以促进糖尿病小鼠的伤口愈合，并减轻高血糖水平引起的内皮功能障碍。相反，抑制CD73会损害这些治疗效果。CD73可以通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）依赖的途径调节血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达。此外，CD73表达还被证明可以调节PI3K/Akt信号通路的激活，从而加速糖尿病压疮小鼠的伤口闭合。这些发现为基于MSCs的疗法治疗免疫失调和血管化受损的疾病提供了新的见解。
引言
糖尿病是全球第三大常见慢性疾病，对全球健康构成严重威胁，全球约有4.15亿人受到影响1,2。每年约有2%的糖尿病患者出现足部溃疡，其中14-24%的患者最终需要截肢[3]。糖尿病足溃疡的标准管理策略包括血糖控制、促进血管化、清创、全接触石膏固定、减压以及使用适当的伤口敷料[2]。尽管采取了这些干预措施，仍有大量患者无法实现伤口愈合[4]。导致糖尿病患者伤口愈合延迟的主要因素包括血液供应不足、生长因子缺乏、炎症过度和微循环功能障碍[5]。因此，糖尿病伤口愈合是一个紧迫的临床挑战。
局部微环境的变化，尤其是高血糖微环境，会导致局部坏死组织中的一些细胞成分和其他因素发生变化，从而影响溃疡的发展，并最终导致糖尿病伤口的形成6, 7。最近的研究表明，高血糖可以增加促炎细胞因子的表达，诱导神经细胞的氧化应激并导致神经病变[8]。此外，高血糖还会促进血红蛋白的糖基化并使血管变窄，导致受伤组织的氧气供应受损[9]。这些病理过程进一步复杂化了伤口微环境，阻止糖尿病伤口的正常愈合。相反，伤口可能会长期处于炎症阶段，导致无法愈合的慢性伤口的形成[10]。此外，细胞因子的异常释放无法有效促进愈合，因为伤口修复是一个依赖于协调的细胞功能和特定细胞因子活性的复杂过程。
干细胞，特别是间充质干细胞（MSCs），越来越多地被用于皮肤再生和伤口愈合[11]。其中，脂肪来源的间充质干细胞（ADMSCs）因其易于获取、采集方便、相关损伤小、干细胞产量高、伦理问题少、免疫原性低而受到广泛关注[12]。研究表明，ADMSCs在 full-thickness 皮肤缺损[13]、糖尿病足溃疡[14]和热损伤[15]的愈合中起着关键作用。然而，大多数这些治疗应用使用的是未分选的ADMSCs群体，而关于在体外或体内环境中使用纯化的ADMSC亚群的研究有限。
体外培养的ADMSCs表现出多样的免疫表型特征，但缺乏明确的标记物[16]。大多数单层培养的ADMSCs缺乏一种或多种MSC表面标记物，且CD73表达经常降低[17]。我们的初步实验表明，CD73表达具有高度异质性，并且与培养时间呈负相关，因为在MSC分化的早期阶段CD73表达会下调[18]。基于这些观察，我们假设CD73可能是一个敏感可靠的ADMSCs标记物。CD73是一种外源性5'-核苷酸酶，是一种广泛表达在细胞膜上的糖蛋白，在酶活性和信号转导方面具有双重功能[19]。研究表明，CD73可以促进细胞增殖并增强克隆能力[20]。在肿瘤学领域，CD73已被发现可以在缺氧条件下促进血管生成，并与多种细胞因子相互作用以支持肿瘤细胞的免疫逃逸[21]。然而，CD73表达对ADMSCs在糖尿病皮肤损伤中的治疗潜力及其潜在机制仍需进一步阐明。
在这项研究中，我们假设CD73的高表达可以促进糖尿病小鼠的伤口愈合。我们提出，由糖尿病压疮微环境紊乱引起的血管生成障碍可以通过CD73+ ADMSCs疗法得到缓解。这项研究的主要目的是阐明CD73表达对ADMSCs在糖尿病皮肤损伤中的治疗效果的影响，从而为CD73+ ADMSCs的临床应用提供理论和实验基础。
CD73+ hADMSCs在糖尿病压疮小鼠模型中改善伤口愈合
为了研究CD73表达是否影响伤口愈合，我们建立了一个使用CD73+ hADMSCs的糖尿病压疮小鼠模型（图1A）。通过慢病毒转导获得稳定的CD73沉默hADMSCs。转染72小时后，荧光强度增加（图S1A）。qRT-PCR和Western blot分析表明，CD73 siRNA组的CD73表达显著降低（图S1B-S1D）。C57BL/6糖尿病压疮模型小鼠
讨论
在这项研究中，我们建立了糖尿病压疮小鼠模型来研究hADMSCs中CD73的功能。我们的结果显示，CD73- hADMSC组的伤口愈合率和VEGFA表达显著低于CD73+ hADMSC组。在高血糖和缺氧条件下，CD73阴性hADMSC条件培养基中的HUVECs迁移能力明显降低，而在CD73阳性hADMSC条件培养基中则增强。
结论
总之，我们的结果表明，CD73+ hADMSCs通过PI3K/Akt信号通路调节HIF-1α/VEGFA表达来促进糖尿病压疮模型中的血管生成。相反，抑制CD73会降低hADMSCs在这些模型中的治疗效果。需要进一步的研究来确定CD73调节HIF-1表达的具体分子靶点，从而阐明这一调控机制的相关性。
作者贡献声明
侯慧芳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，数据管理。张大：撰写 – 原稿，方法学，研究，数据管理。王松：验证，方法学，研究。郑妙云：验证，方法学，研究。白新阳：方法学，研究。王国东：软件，资源，方法学，研究。徐新慧：软件，方法学，研究。郭志坤：撰写 –
数据可用性
本研究生成的所有转录组数据已存入NCBI GEO数据库，访问号为GSE167219。支持本研究结果的数据可向相应作者索取。
动物伦理声明
本研究的动物处理方案和实验程序已获得河南医科大学委员会的批准，符合美国国立卫生研究院批准的动物护理指南（项目名称：CD73阳性脂肪来源的间充质干细胞促进组织再生的功能与机制，批准编号XYLL-2015023，批准日期：2015年6月12日）。人ADMSCs和HUVECs购自Cyagen OriCell，资助
本工作部分由河南省自然科学基金（资助编号：232300421129）、河南省科技研发计划重点项目（资助编号：235101610046）和河南省科技研究项目（资助编号：242102310340、252102310287）的资助。此外，还得到了河南省大学生创新创业培训计划（202410472046）和河南省研究生教育改革与质量提升项目（资助编号：的资助。利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
