血清素受体的特征研究 Aj5-HTR2和Aj5-HTR7在调节日本刺参（Apostichopus japonicus）的昼夜节律过程中可能发挥着重要作用

海胆5-HT受体亚型功能与昼夜节律表达研究揭示Aj5-HTR2和Aj5-HTR7通过Ca2+和cAMP信号通路响应5-HT刺激，神经环与肌肉组织呈现昼夜特异性表达模式，为 echinoderms神经内分泌调控机制研究提供新依据。

　　

王一博|刘玉婷|叶志清|葛丽菲|韩冠宇|姜静静|陈宇倩|王继秀|翁洁阳|杨静文|王天明

中国浙江省舟山市浙江海洋大学海洋科学与技术学院海洋种质资源勘探与利用国家工程实验室，邮编316022

摘要

5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一种进化上保守的神经递质，通过5-羟色胺受体（5-HTRs）介导神经内分泌信号传导。在本研究中，我们从日本海参（Apostichopus japonicus）中克隆并功能表征了两种5-HT受体亚型：Aj5-HTR₂和Aj5-HTR₇。功能检测表明，这两种受体都具有信号传导能力，在5-HT刺激下会迅速内化，并伴随细胞内Ca²⁺或cAMP水平以及MAPK磷酸化的剂量依赖性增加。定量实时PCR结果显示：Aj5-HTR₂在神经环和触须中高表达，而Aj5-HTR₇在Polian囊泡和肌肉中高表达。此外，这两种受体都表现出明显的昼夜表达节律，表明它们在昼夜神经内分泌调节中具有亚型特异性作用。总之，本研究扩展了海参中5-HTRs的种类，并为它们在昼夜神经内分泌调节中的潜在作用提供了新的见解。

引言

日本海参（Apostichopus japonicus）（Selenka, 1867）是一种具有重要经济和营养价值的热带棘皮动物（Xu et al., 2015）。它的运动和摄食活动具有明显的昼夜节律，主要在夜间活动，白天则隐藏起来（Zhao et al., 2023）。这些活动节律在持续黑暗或持续光照条件下仍然存在（Ye et al., 2024），表明其受环境光信号和内源性昼夜节律调节器的共同影响。尽管最近的研究已经探讨了海参的光周期反应和时钟基因表达（Liu et al., 2020, Ye et al., 2024），但将环境信号与昼夜行为联系起来的神经内分泌途径和神经递质系统仍大部分尚未阐明。

5-羟色胺（5-HT，血清素）是一种进化上保守的单胺类神经递质，广泛分布于中枢和外周组织中（Daubert and Condron, 2010, Banskota et al., 2019）。在不同物种中，5-羟色胺能神经元表现出昼夜活动波动，5-HT的释放根据神经背景的不同，既可促进觉醒也可引发睡眠（Sood et al., 2005）。除了在睡眠-觉醒和昼夜调节中的作用外，5-HT还调节食欲、体温调节、感觉反应以及多种行为和生理过程（Green, 2006, Beattie and Smith, 2008）。这种功能多样性源于5-羟色胺受体的分子多样性。在脊椎动物中，已鉴定出七种受体家族（5-HTR_1-7），其中5-HTR₃作为配体门控离子通道，其余家族属于G蛋白偶联受体（GPCR）超家族（Hannon and Hoyer, 2008）。在无脊椎动物中，多个门类中已报道了六种受体亚型，包括线虫、扁形动物、昆虫和软体动物（Hobson et al., 2003; Yang et al., 2019; Kreshchenko et al., 2021）。然而，典型的5-HTR₅型受体尚未被鉴定。这种进化上的差异突显了表征物种特异性5-羟色胺受体的重要性，以阐明它们在非脊椎动物行为和生理调节中的作用。

在多种5-羟色胺受体亚型中，5-HTR₂和5-HTR₇因其独特的信号传导机制及其在神经和昼夜调节中的明确作用而受到特别关注（Nagayama and Lu, 1996, Ehlen et al., 2001）。5-HTR₂主要与G_αq结合，通过二酰甘油（DAG）的产生诱导细胞内Ca²⁺释放并激活蛋白激酶C（PKC）（Cortés-Altamirano et al., 2018）。相比之下，5-HTR₇主要与G_αs结合，升高细胞内cAMP（Guseva et al., 2014），并通过蛋白激酶A（PKA）介导的转录因子（如CREB）磷酸化或EPAC信号通路激活下游通路（Fields et al., 2015, Andreetta et al., 2016）。通过这些不同的通路，5-HTR₂和5-HTR₇产生不同的生理效应，从而在觉醒、神经兴奋性和昼夜调节中发挥各自的作用（Popa et al., 2005, Sprouse et al., 2005, Ciarleglio et al., 2011）。

在脊椎动物中，5-HTR₂和5-HTR₇分别在神经活动和昼夜节律调节中发挥明确的功能。在大鼠中，内源性5-HT在夜间活跃期间激活5-HTR₂，从而兴奋舌下（XII）运动神经元；而5-HTR₂拮抗剂米安塞林可减少与清醒相关的舌肌活动（Kubin and Mann, 2018）。相反，5-HTR₇在视交叉上核（SCN）中调节昼夜节律相位，选择性激动剂如LP-211可促进相位提前并影响情绪相关行为（Ying and Rusak, 1997, Gannon, 2001, Hedlund et al., 2010）。在无脊椎动物中，相关功能研究仍有限，但越来越多的证据表明它们具有保守的作用。在剃刀蛤（Sinonovacula constricta）中，5-HTR₂表现出昼夜表达，并由外源性5-HT诱导产卵行为（You et al., 2023）。在果蝇（Drosophila）中，5-HTR₂参与预期性运动活动，而5-HTR₇通过蘑菇体神经元调节学习和认知（Ganguly et al., 2020）。5-HTR₇还参与扁形动物（Opisthorchis felineus）和蚂蚁（Hymenolepis diminuta）的运动和生殖行为（Yang et al., 2019; Kreshchenko et al., 2021）。然而，它们在棘皮动物中的作用仍大部分未知。

到目前为止，在A. japonicus中仅表征了两种5-HT受体亚型（Aj5-HTR₄、Aj5-HTR_4/6）（Wang et al., 2017, Zhang et al., 2021），而其他关键受体（包括5-HTR₂和5-HTR₇）尚未被研究。昼夜节律显著影响海参的摄食、代谢和整体养殖性能。因此，识别和表征这些受体对于阐明棘皮动物中的5-羟色胺能机制至关重要。本文首次提供了A. japonicus中Aj5-HTR₂和Aj5-HTR₇的分子和功能特征。通过定义它们的信号特性和表达模式，本研究扩展了我们对棘皮动物中5-羟色胺能受体系统的认识，并为理解5-羟色胺能通路在海洋无脊椎动物中的昼夜调节作用提供了框架。

动物适应

动物适应

2024年5月，我们从中国青岛的养殖池塘中收集了成年A. japonicus（体重85.2±5.5克）。这些动物在室内循环海水系统中适应了2周，温度维持在16.0±1.0°C，盐度为28.2–32.5‰。适应期间，海参被喂食由海洋泥（45%）、海藻（50%）和虾壳粉（5%）组成的配方饲料，每天在07:00之前完成喂食。前一天的粪便通过吸管清除。

Aj5-HTR₂和Aj5-HTR₇的分子表征

在A. japonicus基因组中鉴定出两种潜在的5-HT受体，分别命名为Aj5-HTR₂和Aj5-HTR₇。生物信息学分析表明，这两种受体都具有GPCR超家族典型的七次跨膜（7TM）结构域（图1A, D）。还存在保守的功能基序，包括G蛋白激活所需的DRY基序和类视紫红质GPCRs特有的NP_XXY基序（图1B, E）。三级结构建模进一步

讨论

5-羟色胺是一种高度保守的单胺类物质，可调节脊椎动物和无脊椎动物的神经兴奋性、代谢状态和行为节律（Wyler et al., 2017, Bacqué-Cazenave et al., 2020）。在脊椎动物中，它在昼夜节律同步和相位重置中的作用（特别是在视交叉上核中）已被充分证实（Ying and Rusak, 1997, Lu and Nagayama, 1997）。相比之下，5-羟色胺对海洋无脊椎动物节律性生理的调节作用仍不甚明了

结论

本研究鉴定了A. japonicus中Aj5-HTR₂和Aj5-HTR₇的全长编码序列。序列和系统发育分析证实这两种受体均为类视紫红质GPCRs，并分别属于5-HTR₂和5-HTR₇家族。在HEK293细胞中的功能检测显示，5-HT刺激可引发受体内化，增加细胞内Ca²⁺（Aj5-HTR₂）或cAMP（Aj5-HTR₇），并以剂量依赖的方式诱导ERK1/2磷酸化。

作者声明

我们确认本手稿是原创的，未曾发表过，也未在其他地方考虑发表。所有列出的作者均已阅读并批准了本手稿，没有其他符合作者资格但未包含在内的人员。所有作者都对这项工作做出了实质性贡献，同意对稿件的所有方面负责，并批准将其提交给《General and Comparative Endocrinology》。

伦理声明

本研究遵循伦理规范进行，所有实验均符合相关机构和国家的实验室动物护理和使用指南。

未引用的参考文献

Martínez et al. (2017).

CRediT作者贡献声明

王一博：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，正式分析。刘玉婷：验证。叶志清：验证。葛丽菲：验证。韩冠宇：验证。姜静静：验证。陈宇倩：验证。王继秀：撰写 – 审稿与编辑。翁洁阳：撰写 – 审稿与编辑。杨静文：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，概念化。王天明：撰写 – 审稿与编辑，撰写 –

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金杰出青年项目（编号LR24C190001）和国家自然科学基金（编号32373111和32072952）的支持。