《Genes & Diseases》：SOX4-activated lncRNA AC004854.2 promotes colorectal cancer progression by disrupting the PUF60–FUBP1 complex and activating c-MYC transcription
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为解决结直肠癌缺乏有效生物标志物和治疗靶点的问题，本研究聚焦于长链非编码RNA AC004854.2在肿瘤进展中的作用。研究人员通过整合生物信息学、细胞与动物实验，揭示了SOX4转录激活AC004854.2，后者竞争性结合PUF60，破坏PUF60-FUBP1抑制复合体，从而解除对c-MYC启动子远端元件(FUSE)的抑制，激活c-MYC转录，驱动肿瘤增殖与转移。该工作首次阐明SOX4/AC004854.2/PUF60/c-MYC信号轴，为结直肠癌预后评估和靶向治疗提供了新思路。
结直肠癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管手术、化疗和放疗等手段不断进步，许多患者仍面临复发或进展的困境。因此，深入探索结直肠癌发生发展的分子机制，寻找新的生物标志物和治疗靶点，对于改善患者预后至关重要。近年来，长链非编码RNA（lncRNA）作为基因表达的关键调控者，在肿瘤发生发展中扮演着越来越重要的角色，但其在结直肠癌中的具体功能和机制仍有大量未知等待揭示。
为了回答这些问题，研究人员开展了一项系统性研究，首次聚焦于一个名为AC004854.2的lncRNA。他们发现，AC004854.2在结直肠癌组织中显著高表达，且与患者不良预后密切相关。功能实验表明，AC004854.2能促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡。进一步的机制研究揭示，AC004854.2主要定位于细胞核，并特异性结合RNA结合蛋白PUF60。正常情况下，PUF60与FUBP1（FUSE结合蛋白1）在c-MYC原癌基因启动子的远上游元件（FUSE）处形成转录抑制复合体，抑制c-MYC的转录。而AC004854.2的介入，竞争性地与PUF60结合，破坏了PUF60-FUBP1复合体，从而解除了对c-MYC转录的抑制，导致c-MYC及其下游靶基因CCND2、CDK4的表达上调，最终驱动肿瘤的恶性进展。上游调控方面，研究证实转录因子SOX4能够直接结合到AC004854.2的启动子区域，激活其转录表达。体内外实验均证实，使用c-MYC选择性抑制剂IZCZ-3可以逆转AC004854.2过表达所促成的致癌表型。这项研究首次系统阐明了SOX4/AC004854.2/PUF60/c-MYC这一全新的信号轴在结直肠癌进展中的关键作用，不仅将AC004854.2确立为一个潜在的预后生物标志物，也为开发针对该轴的治疗策略提供了理论依据。相关成果发表在《Genes 》上。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据库进行生物信息学分析，筛选与结直肠癌预后相关的lncRNA。其次，通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）、western blot、RNA pull-down结合质谱分析、RNA免疫共沉淀（RIP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）、共免疫共沉淀（Co-IP）等分子生物学技术，在细胞水平验证AC004854.2的功能并解析其与PUF60、FUBP1、c-MYC的相互作用机制。此外，研究还使用了细胞活力（CCK-8）、集落形成、细胞周期与凋亡检测（流式细胞术）、伤口愈合、Transwell迁移与侵袭等细胞功能学实验。在体内层面，构建了裸鼠皮下移植瘤模型，并结合免疫组化（IHC）和原位杂交（ISH）对临床队列（Cohort 1: 106例；Cohort 2: 72例）样本进行分析，以验证AC004854.2的临床相关性。
研究结果
生物信息学分析表明AC004854.2在结直肠癌中上调且与患者不良预后显著相关
基于TCGA等公共数据库的分析显示，AC004854.2在结直肠癌等消化系统肿瘤中表达显著上调。在结直肠癌组织中，其表达水平高于配对癌旁正常组织。生存分析表明，AC004854.2高表达与患者较差的疾病特异性生存、无进展间期和总生存期显著相关，且可作为独立的预后风险因子。
敲低AC004854.2抑制结直肠癌细胞活性与增殖，促进凋亡和G1期细胞周期阻滞，并损害伤口愈合、迁移和侵袭
在RKO和SW1116细胞中敲低AC004854.2，可导致细胞活力下降、BrdU阳性细胞比例减少、集落形成能力减弱，同时增加早期和晚期凋亡细胞比例，诱导G1期细胞周期阻滞，并显著削弱细胞的伤口愈合、迁移和侵袭能力。
过表达AC004854.2增强结直肠癌细胞活力与增殖能力，抑制凋亡和G1期细胞周期阻滞，并促进伤口愈合、迁移和侵袭
在HCT116和HT-29细胞中过表达AC004854.2，可提高细胞活力、增加BrdU阳性细胞百分比、增强集落形成能力，同时降低凋亡细胞比例和G1期细胞比例，并显著提升细胞的迁移和侵袭能力。
AC004854.2竞争性与PUF60相互作用，从而破坏PUF60–FUBP1相互作用并解除c-MYC的转录抑制
AC004854.2主要定位于细胞核。RNA pull-down结合质谱分析、RIP、Co-IP等实验证实，AC004854.2特异性结合PUF60，而非FUBP1。其结合位点位于AC004854.2的P1片段（1–380 nt）和PUF60的RRM1结构域。AC004854.2的过表达破坏了PUF60与FUBP1之间的相互作用，而敲低则增强该作用。ChIP实验显示，AC004854.2沉默增加了PUF60和FUBP1在c-MYC启动子FUSE元件上的占据。AC004854.2过表达上调了c-MYC的mRNA和蛋白水平，而PUF60过表达则抑制c-MYC表达。同时过表达AC004854.2和PUF60可逆转c-MYC及其下游靶点CCND2、CDK4的上调。
AC004854.2通过c-MYC激活促进结直肠癌进展
功能挽救实验表明，在HCT116细胞中过表达AC004854.2所增强的细胞活力、克隆形成、增殖、迁移和侵袭能力，以及所减少的凋亡和G1期阻滞，均可被c-MYC抑制剂IZCZ-3处理所逆转，证明AC004854.2的致癌效应依赖于c-MYC信号。
AC004854.2通过c-MYC激活在移植瘤模型中促进结直肠癌发展
裸鼠皮下移植瘤实验显示，过表达AC004854.2的HCT116细胞形成的肿瘤体积更大、重量更重，且肿瘤组织中增殖标志物Ki-67、CCND2、CDK4、E-钙粘蛋白和c-MYC表达增强。这些效应同样可被IZCZ-3处理所抑制，进一步在体内验证了AC004854.2通过激活c-MYC驱动肿瘤生长。
SRY-box转录因子4（SOX4）通过结合其启动子激活AC004854.2表达
生物信息学及临床样本分析显示，AC004854.2与SOX4表达呈显著正相关。在细胞中敲低SOX4可降低AC004854.2表达，而过表达SOX4则上调其表达。JASPAR数据库预测及ChIP、荧光素酶报告基因实验证实，SOX4直接结合于AC004854.2启动子区的特定位点（P4，转录起始点上游-1329至-1340 bp），并激活其转录。
AC004854.2作为结直肠癌患者的潜在预后生物标志物
在临床队列（Cohort 2）的72对结直肠癌组织样本中证实，AC004854.2在癌组织中表达显著高于癌旁组织。其表达与下游靶点c-MYC、CCND2、CDK4的蛋白水平呈正相关。对154名患者的生存分析显示，AC004854.2高表达是总生存期缩短的独立预测因子。
结论与讨论
本研究首次系统阐明了长链非编码RNA AC004854.2在结直肠癌中的致癌功能与分子机制。研究结论可归纳为以下几点：1) AC004854.2在结直肠癌中高表达，是提示不良预后的独立风险因子，具备作为诊断和预后生物标志物的潜力。2) 功能上，AC004854.2能促进结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭，并抑制凋亡。3) 机制上，AC004854.2位于细胞核，通过其P1片段竞争性结合PUF60蛋白的RRM1结构域，破坏PUF60-FUBP1抑制复合体在c-MYC启动子FUSE元件的形成，从而解除对c-MYC转录的抑制，激活c-MYC信号通路。4) 上游调控方面，转录因子SOX4直接结合并激活AC004854.2的转录，从而构成了SOX4/AC004854.2/PUF60/c-MYC这一全新的信号轴。5) 体内外实验均证实，AC004854.2的促癌效应依赖于c-MYC的激活，可被c-MYC抑制剂逆转。
这项研究的重要意义在于：它首次揭示了AC004854.2这一此前未充分表征的lncRNA在结直肠癌中的关键作用，并阐明了一条独立于经典WNT/β-catenin通路、通过启动子近端调控精细调整c-MYC转录的新机制。这不仅深化了对结直肠癌发病分子机理的理解，填补了相关知识空白，更重要的是，AC004854.2及其上下游分子（SOX4, PUF60）作为潜在的预后指标和治疗靶点，为结直肠癌的精准诊断和治疗策略开发提供了新的思路和理论依据。针对该信号轴，尤其是破坏AC004854.2与PUF60相互作用或使用c-MYC抑制剂，可能成为未来有前景的治疗方向。
