《Immunobiology》：HNRNPDL facilitates the advancement of non-small cell lung carcinoma via modulating the alternative splicing of the BTC gene
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本刊推荐：为探索可变剪接在非小细胞肺癌（NSCLC）中的致癌机制，本研究聚焦剪接调控因子HNRNPDL及其下游靶基因BTC。研究发现，HNRNPDL在NSCLC中高表达，通过调控BTC第4外显子的选择性剪接，产生两种功能冗余的致癌剪接变体BTC-L和BTC-S，二者均能促进肺癌细胞增殖、迁移并抑制凋亡。该工作首次揭示了“HNRNPDL-BTC”轴在NSCLC进展中的关键作用，为基于RNA剪接调控的靶向治疗提供了新思路。
肺癌，尤其是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC），长久以来都是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了显著进展，但许多患者仍面临疗效有限、耐药复发等严峻挑战。在肿瘤复杂的发生发展网络中，基因表达的精细调控环节日益受到关注，其中，可变剪接（Alternative Splicing, AS）——即一个基因通过不同剪接方式产生多种信使RNA（mRNA）变体的过程——被认为是癌症中蛋白质多样性和功能异质性的重要来源。异常的可变剪接事件与肿瘤的增殖、侵袭、转移及治疗抵抗密切相关，因此，解析关键剪接调控因子在特定癌症中的作用机制，有望发现全新的治疗靶点。
在众多的剪接调控因子中，异质核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP）家族成员扮演着重要角色。然而，与家族中其他被广泛研究的成员（如HNRNPL）相比，HNRNPDL在癌症中的功能，尤其是在NSCLC中的具体作用和分子机制，尚不明确。既往研究多集中于观察HNRNPDL表达水平与肿瘤表型的相关性，但其是否通过识别独特的顺式作用元件，调控下游特定靶基因的可变剪接，从而在NSCLB中执行有别于其他hnRNP蛋白的特定功能，仍是未知数。同时，Betacellulin（BTC）作为表皮生长因子受体（EGFR）的配体，在多种癌症中均有表达，但其在NSCLC中的剪接变体形式、功能及调控机制亦未被揭示。
为了解决这些问题，由曹玉洁、刘茜等人组成的研究团队在《Immunobiology》上发表了一项研究，系统探究了HNRNPDL在NSCLC中的致癌角色。他们的核心目标是：确定HNRNPDL调控的关键可变剪接事件，阐明由此产生的BTC剪接变体（BTC-L和BTC-S）是否作为下游效应分子发挥作用，并评估“HNRNPDL-BTC”轴作为潜在治疗靶点的可能性。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）在A549和H1299这两种人肺腺癌细胞系中稳定敲低HNRNPDL、BTC-L或BTC-S的表达，并通过Western Blot和实时定量PCR（RT-qPCR）验证敲低效率与特异性。其次，通过RNA测序（RNA-seq）及rMATS分析，筛选HNRNPDL敲低后下游差异表达的基因及显著变化的可变剪接事件。接着，采用CCK-8法、EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）掺入实验、细胞划痕实验以及Western Blot检测凋亡相关蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase3/9等）表达，分别系统评估了HNRNPDL及BTC剪接变体对肺癌细胞活力、增殖、迁移和凋亡的影响。此外，还通过免疫荧光实验观察了HNRNPDL与BTC的蛋白表达与共定位情况。
3.1. HNRNPDL的蛋白和mRNA水平在人肺腺癌细胞中上调
研究人员发现，与正常支气管上皮细胞BEAS-2B相比，在A549和H1299这两种NSCLC细胞系中，HNRNPDL的蛋白和mRNA表达水平均显著上调，提示HNRNPDL可能是一个癌基因。
3.2. 低HNRNPDL敲低肺腺癌细胞的转染效率
通过构建shRNA慢病毒，成功在A549和H1299细胞中实现了HNRNPDL的稳定敲低，为后续功能研究奠定了基础。
3.3. HNRNPDL在NSCLC中发挥致癌作用
功能实验表明，敲低HNRNPDL能显著抑制NSCLC细胞的活力、增殖能力和迁移能力，同时诱导细胞凋亡（表现为促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase3/9上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调），证实了HNRNPDL在体外具有促癌功能。
3.4. 生物信息学分析揭示NSCLC中BTC第4外显子异常剪接
对HNRNPDL敲低的细胞进行RNA-seq分析，发现了一个显著的可变剪接事件：基因BTC（Betacellulin）的第4外显子（147bp）存在选择性包含或跳过，从而产生两种主要转录本：包含外显子4的BTC-L和跳过外显子4的BTC-S。
3.5. BTC是HNRNPDL的下游致癌因子
实验证实，HNRNPDL能调控BTC的表达，敲低HNRNPDL会导致BTC蛋白水平下降。与正常细胞相比，BTC-L和BTC-S在NSCLC细胞中均显著上调，且与HNRNPDL的表达模式相关。
3.6. 低剪接体BTC敲低肺腺癌细胞的转染效率
研究人员构建了分别靶向BTC-L和BTC-S的特异性shRNA，成功实现了对两种剪接变体的特异性敲低，且互不干扰，为后续研究其独立功能提供了工具。
3.7. BTC-L和BTC-S在体外表现出功能冗余的致癌活性
功能缺失实验表明，分别敲低BTC-L或BTC-S，均能显著抑制NSCLC细胞的活力、增殖和迁移，并诱导细胞凋亡，且产生的表型抑制程度相当。这说明两种剪接变体在促进NSCLC恶性表型方面具有相似且独立的功能，呈现出功能冗余的特性。
本研究通过一系列体外实验，首次系统阐明了剪接因子HNRNPDL通过调控BTC基因的可变剪接驱动NSCLC进展的分子机制。主要结论可归纳为以下几点：首先，HNRNPDL在NSCLC细胞中异常高表达，其本身具有促进细胞增殖、迁移并抑制凋亡的致癌功能。其次，HNRNPDL是BTC基因第4外显子可变剪接的关键调控因子，其敲低会导致BTC剪接模式的改变。第三，HNRNPDL调控产生的两种BTC剪接变体（BTC-L和BTC-S）在NSCLC细胞中均高表达，且二者在功能上冗余，均能独立地促进癌细胞的恶性生物学行为。因此，该研究揭示了一条全新的“HNRNPDL-BTC”调控轴在NSCLC发病机制中的重要作用。
在讨论中，作者将本研究置于更广阔的背景下。他们指出，与hnRNP家族其他成员（如HNRNPA1、HNRNPL）调控不同靶点不同，本研究首次明确了HNRNPDL通过调控BTC剪接在NSCLC中的独特作用。尽管既往研究提示BTC在NSCLC中表达升高并与EGFR信号形成正反馈环，但对其剪接变体的功能未有涉及，本研究填补了这一空白。作者也客观指出了本工作的局限性，如结论主要基于体外细胞实验，缺乏动物体内验证和临床样本分析；尚未提供HNRNPDL直接结合BTC前体mRNA的分子互作证据；也未进行BTC剪接变体在HNRNPDL敲低细胞中的回补实验等。这些为未来研究指明了方向，包括利用剪接报告系统、CLIP-seq（紫外交联免疫沉淀结合高通量测序）等技术深入阐明直接调控机制，以及在动物模型和临床队列中验证该通路的转化价值。
综上所述，这项研究不仅深化了对hnRNP家族蛋白在肿瘤中特定功能的理解，更重要的是，它将RNA剪接异常与NSCLC的进展直接联系起来，揭示了“HNRNPDL-BTC”轴作为一个潜在的、统一的治疗靶点的可能性。在精准医疗时代，除了针对驱动基因突变，靶向剪接调控过程为代表的关键基因表达调控环节，为NSCLC的治疗提供了新的思路和策略。
