来自干酪乳杆菌1.0351的酪蛋白水解产物的抗氧化肽的特性及其作用机制的分子对接研究

《International Dairy Journal》：Characteristics of antioxidant peptides derived from casein hydrolysis products of Lactobacillus casei 1.0351 and exploration of their pathway of action by molecular docking

本研究系统探究了两种乳杆菌casei（1.0351和1.0319）水解乳清蛋白的生成特性、水解位点分布及抗氧化活性机制。结果显示，1.0351菌株48小时内水解度达17.81±1.23%，其<3kDa的F1组分抗氧化活性最强，通过HPLC-MS/MS鉴定出444条肽段，生物信息学筛选出10条高活性肽（如PVVVPPFL），网络药理学分析表明其可能通过STAT3、CTSBR、ACE等靶点调控心血管疾病和凋亡相关通路，分子对接证实PVVVPPFL与ACE结合能-9.3 kcal/mol，提示其抑制ACE活性缓解氧化应激的潜力。本研究为乳酸菌源抗氧化肽的生成机制及功能食品开发提供了新理论依据。

　　

杜颖颖|赵哲|李贺|张秀秀|李晓东|孙宇涵|张永根

中国哈尔滨市香坊区长江街600号，东北农业大学食品学院，邮编150030

摘要

本研究探讨了不同干酪乳杆菌水解物中抗氧化肽的生成特性、水解位点分布及其潜在作用途径。与L. casei 1.0319相比，L. casei 1.0351表现出更强的酪蛋白水解活性，在48小时内达到了(17.81 ± 1.23)%的水解程度。其酪蛋白水解物具有很强的抗氧化活性。超滤分离结果显示，分子量小于3 kDa的肽（F1组分）具有最强的抗氧化活性。进一步的高效液相色谱（HPLC）分析鉴定了该组分中的444种肽，主要来源于α_S1-酪蛋白和β-酪蛋白。生物信息学筛选确定了10种潜在的高活性抗氧化肽（GPVRGPFP、MPIQAFLL、GPVRGPFPII、FPKYPVEPF、APFPEVFGK、HLPLPLL、NQFLPYPY、PHPHLSF、LHLPLPLL、PVVVPPFL）。网络药理学分析表明，这些肽的作用可能涉及STAT3、CTSB和ACE等关键靶点。KEGG通路富集分析表明，这些肽可能通过调节与心血管疾病和细胞凋亡相关的通路来发挥抗氧化作用。分子对接结果预测，肽PVVVPPFL与ACE的结合亲和力较强（-9.3 kcal/mol），提示它可能通过抑制ACE活性来缓解氧化应激。本研究为深入理解乳酸菌来源的抗氧化肽的生成机制及其在功能性食品开发中的应用提供了理论基础。

引言

益生菌是一类对宿主健康有益的活微生物，具有改善肠道健康、调节免疫功能和促进代谢稳态的潜在价值（Hill等人，2014年）。某些菌株（如干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和短双歧杆菌）不仅可以广泛用作乳制品、植物基饮料和益生菌补充剂的发酵剂，还可以通过其蛋白水解活性产生多种生物活性肽（Li等人，2024年）。生物活性肽通常由2到20个氨基酸组成，作为蛋白质中的特定片段，它们具有多种生理功能，包括抑制血管紧张素转换酶（ACE）、抗菌、免疫调节和抗氧化（Jakubczyk等人，2020年）。在各种生物活性肽中，抗氧化肽近年来成为研究热点，由于它们能够消除活性氧（ROS）和自由基以及螯合金属离子，因此在延缓衰老、预防心血管疾病和食品保鲜等领域显示出广泛的应用前景（Chen等人，2024年；Shu等人，2018年）。

干酪乳杆菌是一种重要的益生菌，通过调节肠道微生物群和增强机体免疫力，表现出优异的抗炎和抗氧化特性（Huo等人，2025年）。此外，该菌株还被证明可以缓解乳糖不耐受、降低血脂和改善代谢紊乱（Chen等人，2024年；Marco等人，2021年；Min等人，2023年）。基于这些功能，它被广泛用于发酵食品、功能性食品、特殊医用食品等领域（Fan & Jia，2023年）。现有研究表明，干酪乳杆菌通过其蛋白水解系统有效释放多种生物活性肽，包括ACE抑制肽、抗菌肽和免疫调节肽（Liu等人，2025年；Obaroakpo等人，2019年）。值得注意的是，先前的研究还表明干酪乳杆菌具有生成抗氧化肽的能力。例如，Shu等人（2018年）发现干酪乳杆菌 L61在山羊奶发酵过程中产生的肽能有效清除多种自由基，并在模拟的胃肠道条件下保持稳定。Chen等人（2024年）报道，干酪乳杆菌发酵牛蒡根显著降低了高脂饮食小鼠的氧化应激水平。这些研究表明干酪乳杆菌在抗氧化研究中具有潜在的应用价值。然而，关于干酪乳杆菌促进抗氧化肽产生的系统研究仍然有限，需要进一步深入探索。

干酪乳杆菌的蛋白水解系统独特之处在于同时存在三种已知的肽转运系统：寡肽渗透系统（Opp）、二肽渗透系统（Dpp）和二/三肽转运蛋白（DtpT），而其他乳酸菌种类（如罗伊氏乳杆菌）仅具有一种系统（DtpT）。这种结构复杂性，加上高度协调的细胞壁蛋白酶（如PrtP）和特定的细胞内肽酶，确保了多种生物活性肽的有效释放和吸收（Liu等人，2010年）。研究表明，干酪乳杆菌的蛋白水解系统在酪蛋白降解过程中表现出明显的位点特异性，优先切割疏水性和芳香性氨基酸残基以及Pro附近的肽键（Fan & Jia，2023年）。干酪乳杆菌的壁蛋白酶对α₁-酪蛋白和β-酪蛋白具有明显的水解活性，表现出底物识别的位点特异性——例如，优先切割P1位点为Met或Asn、P1′位点为Ala或Asp的肽键（Solieri等人，2022年）。在这种选择性作用下，干酪乳杆菌释放出多种具有抗氧化潜力的短肽，包括来自β-酪蛋白的VKEAMAPK、来自α₁-酪蛋白的YLGYLEQLLR和来自κ-酪蛋白的YIPIQYVLSR。这些肽在DPPH和ABTS自由基清除试验中表现出显著的活性（Cui等人，2022年）。然而，目前的研究主要集中在抗氧化肽的鉴定和活性评估上，缺乏对这些肽片段与特定水解位点之间内在关系的系统分析。从水解位点分布的角度来看，这项分析可能为复杂蛋白质底物如何生成特定功能肽提供新的见解。

本研究采用酪蛋白发酵系统，比较了两种干酪乳杆菌菌株（干酪乳杆菌 1.0351和干酪乳杆菌 1.0319）产物的水解能力和抗氧化活性。利用HPLC-MS/MS作为核心技术鉴定肽序列，并分析其特征，以建立肽与水解位点之间的关联。通过整合网络药理学和分子对接技术，本研究构建了由干酪乳杆菌产生的酪蛋白水解物中抗氧化肽的相互作用网络。与以往主要关注肽鉴定或活性评估的研究不同，本研究从水解位点的角度出发，将肽的生成与特定的蛋白水解模式联系起来。这种方法为干酪乳杆菌发酵过程中抗氧化肽的产生机制提供了新的见解，加深了对其酶系统功能特性的理解，并为功能性食品的开发提供了重要的参考价值。

材料

干酪乳杆菌 1.0351和干酪乳杆菌 1.0319来自中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学食品学院的重点实验室。这两种干酪乳杆菌菌株以50%（v/v）的比例接种到甘油管中，并在-80 °C下冷冻保存。实验过程中，首先将菌株转移到脱脂牛奶培养基中，在37 °C下厌氧培养24小时，然后继续激活

不同干酪乳杆菌水解酪蛋白的水解程度分析

蛋白质水解程度是评估不同菌株产生肽键数量的指标，数值越大，释放的氨基酸越多（Sah等人，2014年）。表1显示了不同干酪乳杆菌水解酪蛋白的水解程度。随着水解时间的延长，干酪乳杆菌的水解程度逐渐增加。L. casei 1.0351在每个时间点的水解程度均高于L. casei

结论

本研究系统阐明了L. casei 1.0351通过酪蛋白发酵产生抗氧化肽的特性。结果表明，L. casei 1.0351具有出色的酪蛋白水解能力和抗氧化活性，在48小时内高效释放了多种生物活性肽。其中，分子量小于3 kDa的肽F1表现出最强的抗氧化活性。通过LC-MS/MS鉴定出444种肽

CRediT作者贡献声明

杜颖颖：撰写——原始草案、可视化、方法学、概念化。赵哲：可视化、资源获取、数据管理。李贺：实验研究、数据管理。张永根：可视化、验证。孙宇涵：可视化。张秀秀：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学。李晓东：验证、概念化

利益冲突声明

本手稿的提交不存在利益冲突，所有作者均同意发表。

数据可用性

数据可应要求提供。

资金来源

本工作得到了黑龙江省自然科学基金的资助（LH2023C032）。

利益冲突声明

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